Funciones conductuales de las aminas biogénicas en machos de abejorros

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20946 (2022) Citar este artículo

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Para comparar los roles conductuales de las aminas biogénicas en los machos de las abejas eusociales primitivas y avanzadas, determinamos los niveles de sustancias relacionadas con la dopamina y la octopamina en el cerebro, y los efectos conductuales de estas monoaminas mediante inyección de drogas en el abejorro eusocial primitivo. , bombus ignitus. Los niveles de dopamina y sus precursores en el cerebro alcanzaron su punto máximo en la etapa pupal tardía, pero el pico de dopamina se extendió hasta la emergencia del adulto. Los niveles de tiramina y octopamina aumentaron desde la pupa media hasta la etapa adulta. Las actividades locomotoras y de vuelo, y la preferencia por la luz aumentaron con la edad. La inyección de octopamina y su antagonista del receptor tuvo efectos significativos sobre las actividades locomotoras y de vuelo, mientras que la inyección de dopamina no, lo que indica que estas actividades pueden ser reguladas por el sistema octopaminérgico. También determinamos la dinámica de las sustancias relacionadas con la dopamina en los zánganos de las abejas melíferas (Apis mellifera). Los cambios en el nivel de dopamina en los cerebros de los zánganos de las abejas melíferas exhibieron dos picos desde las etapas de pupa hasta las adultas, mientras que los machos de abejorros tenían solo un pico. Estos son consistentes con las funciones conductuales de la dopamina en los zánganos de las abejas melíferas y la ineficacia de la inyección de dopamina en la etapa adulta en los abejorros machos.

La eusocialidad es el sistema social más complejo, con división del trabajo entre individuos relacionados genéticamente, y ha sido reportada en varias especies en una amplia gama de taxones de insectos1,2,3,4. En los himenópteros eusociales, los comportamientos sociales que involucran la cooperación entre los miembros de la colonia solo se observan en las hembras. Los himenópteros eusociales machos se especializan en la reproducción y no participan en la construcción del nido, el cuidado de las crías o la defensa de la colonia1,2,5, aunque los machos de las abejas eusociales contribuyen a la termorregulación colonial6,7. Por lo tanto, los repertorios de comportamiento de los hombres son mucho más pequeños que los de los trabajadores. La investigación de los comportamientos de los machos y los mecanismos fisiológicos asociados puede proporcionar información importante sobre la especialización del comportamiento para la reproducción en los machos en entornos muy sociales.

En entornos eusociales avanzados, los comportamientos de los zánganos de las abejas melíferas (Apis mellifera) se han investigado en varios campos de investigación, como la genética, la endocrinología, la biología reproductiva y la biología evolutiva8. Los zánganos de abeja maduran sexualmente durante una semana después de emerger y comienzan a volar para aparearse con reinas vírgenes5,9. Las actividades locomotoras y de vuelo asociadas a la reproducción en zánganos aumentan con la edad durante su maduración sexual10. Los zánganos de abejas melíferas regresan a la colonia madre, mientras que los machos de abejorros no aprenden la ubicación de la colonia y nunca regresan a la colonia7,11,12. Después de abandonar el nido, los machos de abejorros se alimentan por sí mismos mientras buscan ginebras para aparearse. Esto puede deberse a la producción de machos al final de la temporada de colonias, cuando disminuye el estado nutricional de las colonias de abejorros. Por lo tanto, la dependencia de los machos de la colonia difiere entre la abeja melífera y el abejorro, lo que podría reflejar la adaptación del comportamiento de los machos a diferentes entornos sociales.

Las aminas biogénicas son agentes fisiológicos que funcionan como neurotransmisores, neuromoduladores y neurohormonas en varias especies de insectos13,14,15,16,17. Estas sustancias están involucradas en la división del trabajo relacionada con la edad en las abejas obreras18,19 y el comportamiento reproductivo de las reinas vírgenes20,21. En los zánganos de las abejas melíferas, los niveles de dopamina y octopamina en el cerebro aumentan con la edad10,22,23. La inyección de estas monoaminas en la hemolinfa de los zánganos mejora sus actividades locomotoras y de vuelo10,23. Por lo tanto, los aumentos en los niveles de dopamina y octopamina en el cerebro pueden estar estrechamente relacionados con las actividades de vuelo de apareamiento en los zánganos de las abejas melíferas. La dopamina también mejora las actividades locomotoras y de vuelo en los machos de la abeja solitaria Xylocopa appendiculata24, que comparte un ancestro común en Apidae25. Por lo tanto, la regulación del comportamiento reproductivo masculino por aminas biogénicas podría ser compartida entre las abejas eusociales y debería probarse en otras especies dentro de un clado monofilético, como las abejas corbiculadas.

Los abejorros comprenden un gran grupo de abejas eusociales primitivas, y son especies ideales para investigar el eslabón perdido entre las especies eusociales solitarias y avanzadas, aunque el análisis multidimensional de los comportamientos sociales sugiere la pequeña diferencia de complejidad social entre las abejas melíferas y los abejorros26. Los abejorros machos se producen desde finales del verano hasta principios del otoño en colonias completamente desarrolladas en regiones templadas2,7. El papel principal de los machos de abejorros en la colonia es la reproducción, y pueden aparearse con diferentes gynes en contraste con los zánganos de abejas melíferas de apareamiento único. Los machos de abejorros completan su maduración sexual entre 6 y 9 días después de emerger e inician el apareamiento con los gynes27. Esclarecer los mecanismos fisiológicos que subyacen en el comportamiento reproductivo de los machos de abejorros y compararlos con los de la abeja melífera puede mejorar nuestra comprensión de la adaptación del sistema de regulación del comportamiento reproductivo masculino al entorno social. Sin embargo, ningún estudio previo ha informado sobre la regulación del comportamiento reproductivo por parte de aminas biogénicas en machos de abejorros. Por lo tanto, en el presente estudio, investigamos la dinámica de los niveles de aminas biogénicas en el cerebro y los efectos de las aminas biogénicas en el comportamiento reproductivo en machos de abejorros (B. ignitus). También comparamos los mecanismos en el abejorro y la abeja melífera para determinar si los mecanismos mediados por aminas biogénicas difieren entre las dos especies.

Inicialmente, determinamos los niveles de dopamina, octopamina y sus precursores en los cerebros de pupas y adultos machos de abejorros mediante el uso de sistemas de cromatografía líquida de alta resolución con detección electroquímica (HPLC-ECD). Los niveles de dos precursores de dopamina (tirosina y DOPA, Fig. 1A) aumentaron con la edad durante la etapa de pupa (P0–1 a P6–7), pero disminuyeron antes de la emergencia (P8–9 a A0) y luego permanecieron en niveles constantes más bajos durante el estado adulto (A2 a A8) en comparación con los del estado pupal (tirosina: Kruskal-Wallis: H = 106,500, df = 9, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 1B; DOPA: Kruskal –Wallis: H = 88.300, df = 9, P < 0.001, Steel–Dwass: P < 0.05, Fig. 1C). Sin embargo, los niveles de dopamina aumentaron con la edad durante el estado de pupa y permanecieron en los niveles más altos desde el final del estado de pupa (P8-9) hasta la emergencia del adulto (A0), luego disminuyeron (A2-A8) (Kruskal-Wallis: H = 88,599, df = 9, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 1D). Los cambios en los niveles de dopamina fueron básicamente similares a los de los niveles de tirosina y DOPA, pero la disminución en el nivel de dopamina después de la emergencia se retrasó en comparación con las disminuciones en los precursores de dopamina.

Cambios dependientes de la edad en sustancias relacionadas con la dopamina normalizadas por proteína cerebral en machos de abejorros. (A) Vía sintética para sustancias relacionadas con la dopamina. Se muestran los niveles de tirosina (B), DOPA (C) y dopamina (D) en el cerebro. Las barras de error indican errores estándar. Las diferencias significativas según la prueba de Steel-Dwass (P < 0,05) se indican con letras diferentes. Los tamaños de muestra se muestran entre paréntesis.

La tiramina es un metabolito de la tirosina, un precursor de la octopamina y tiene su propia función en los insectos15,28 (fig. 2A). Los niveles de tiramina se mantuvieron constantes durante la etapa de pupa, aumentaron desde el final de la etapa de pupa (P8–9) hasta la emergencia del adulto (A0) y permanecieron en niveles más altos durante la etapa de adulto (A0–A8) que la etapa de pupa ( Kruskal-Wallis: H = 79,481, gl = 9, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 2B). Los niveles de octopamina aumentaron desde la etapa de pupa media (P4-5) hasta la etapa adulta (Kruskal-Wallis: H = 80.097, df = 9, P <0.001, Steel-Dwass: P <0.05, Fig. 2C). Por lo tanto, los niveles de dos fenolaminas (tiramina y octopamina) derivadas de la tirosina aumentaron gradualmente con la edad desde la pupa media hasta la etapa adulta.

Cambios dependientes de la edad en sustancias relacionadas con octopamina normalizadas por proteína cerebral en machos de abejorros. (A) Vía sintética para sustancias relacionadas con la octopamina. Se muestran los niveles de tiramina (B) y octopamina (C). Las barras de error indican errores estándar. Las diferencias significativas según la prueba de Steel-Dwass (P < 0,05) se indican con letras diferentes. Los tamaños de muestra se muestran entre paréntesis.

Para investigar los cambios en las actividades de comportamiento con la edad, se midieron las actividades locomotoras y de vuelo de los abejorros machos a diferentes edades. La actividad locomotora aumentó significativamente de A0 a A4 y luego permaneció en niveles más altos constantes (Kruskal-Wallis: H = 46.139, df = 4, P <0.001, Steel-Dwass: P <0.05, Fig. 3A). La proporción de individuos que caminaban en la cámara anular aumentó de A0 a A4, con hasta un 100 % en A6 y A8 (prueba exacta de Fisher con corrección de Bonferroni: P < 0,05, Fig. 3B). La actividad de vuelo aumentó significativamente con la edad en paralelo con la actividad locomotora (prueba exacta de Fisher con corrección de Bonferroni: P < 0,05, Fig. 3C). La duración de la residencia en el área roja disminuyó significativamente con la edad (Kruskal-Wallis: H = 19.634, df = 4, P < 0.001, Steel-Dwass: P < 0.05, Fig. 3D), lo que indica que los machos gradualmente prefirieron la luz. área con la edad.

Cambios dependientes de la edad en las actividades de comportamiento en machos de abejorros: (A-B) actividad locomotora espontánea, (C) actividad de vuelo espontáneo y (D) preferencia por la luz indicada por la duración de residir en el área roja. La actividad locomotora y la duración de la residencia en el área roja se indican mediante diagramas de caja. Las diferencias significativas según la prueba de Steel-Dwass (P < 0,05) o la prueba exacta de Fisher con correlación de Bonferroni (P < 0,05) se indican con letras diferentes. Los tamaños de muestra se muestran entre paréntesis.

Para determinar los efectos de la dopamina en el comportamiento, medimos las actividades locomotoras y de vuelo y la preferencia por la luz en machos inyectados con dopamina. La actividad locomotora no difirió significativamente entre el control y los individuos inyectados con dopamina (Kruskal-Wallis: H = 4.705, df = 3, P = 0.195, Fig. 4A). La latencia del inicio del vuelo no difirió significativamente entre el control y los individuos inyectados con dopamina (Kruskal-Wallis: H = 4.354, df = 3, P = 0.226, Fig. 4B). La duración de la residencia en el área roja no difirió significativamente entre el control y los individuos inyectados con dopamina (Kruskal-Wallis: H = 1.209, df = 3, P = 0.751, Fig. 4C). Por lo tanto, la inyección de dopamina no afectó las actividades locomotoras y de vuelo y la respuesta a la luz en los machos.

Efectos de la inyección de dopamina en las actividades conductuales de machos de 4 días de edad en el abejorro: (A) actividad locomotora espontánea, (B) duración del inicio del vuelo y (C) duración del tiempo que reside en el área roja como una preferencia ligera índice. La actividad locomotora, la duración de la iniciación y la duración de la residencia en el área roja se indican mediante diagramas de caja. Los tamaños de muestra se muestran entre paréntesis.

La actividad locomotora fue significativamente mayor en los individuos tratados con octopamina 10-3 M que en los individuos control (prueba de Kruskal-Wallis: H = 8,764, df = 3, P < 0,05; Steel: P < 0,05, Fig. 5A). Se observó una tendencia similar en los machos tratados con octopamina 10–4 M, pero no se detectaron diferencias significativas con los machos de control. La latencia del inicio del vuelo no difirió significativamente entre el control y los individuos inyectados con octopamina (Kruskal-Wallis: H = 1.315, df = 3, P = 0.726, Fig. 5B). La duración de la residencia en el área roja no difirió significativamente entre el control y los individuos inyectados con octopamina (Kruskal-Wallis: H = 0.976, df = 3, P = 0.807, Fig. 5C).

Efectos de la inyección de octopamina en las actividades conductuales de machos de 4 días de edad en el abejorro: (A) actividad locomotora espontánea, (B) duración del inicio del vuelo, (C) duración del tiempo de residencia en el área roja como índice de preferencia por la luz . La actividad locomotora, la duración de la iniciación y la duración de la residencia en el área roja se indican mediante diagramas de caja. Una diferencia significativa según la prueba de Steel (P < 0,05) se indica con un asterisco. Los tamaños de muestra se muestran entre paréntesis.

La actividad locomotora de los machos 15 minutos después de la inyección de epinastina fue significativamente menor que la del control (Mann-Whitney U: Z = 3.304, P <0.001, Fig. 6A). La actividad de los machos no difirió entre los machos de control y los tratados a las 24 h después de la inyección (U de Mann-Whitney: Z = 1.447, P = 0.148, Fig. 6A), lo que indica la recuperación de la inhibición por epinastina. La latencia de la iniciación del vuelo en los machos a los 15 min después de la inyección de epinastina fue significativamente mayor en comparación con los machos de control (U de Mann-Whitney: Z = 2,573, P < 0,05, Fig. 6B), y la latencia en los machos se recuperó de la inhibición a los 24 h después de la inyección y no difirió entre los machos de control y los tratados (Z = 0,534, P = 0,593, Fig. 6B). La duración de residir en el área roja no difirió significativamente entre los machos de control y los tratados (15 min: Mann-Whitney U: Z = 0,829, P = 0,407; 24 h: Z = 1,328, P = 0,184, Fig. 6C) .

Efectos de la inyección de epinastina (antagonista del receptor de octopamina) en las actividades conductuales de machos de 4 días de edad en el abejorro: (A) actividad locomotora espontánea, (B) duración del inicio del vuelo, (C) duración del tiempo de residencia en el área roja como índice de preferencia por la luz. La actividad locomotora, la duración de la iniciación y la duración de la residencia en el área roja se indican mediante diagramas de caja. Las diferencias significativas entre los grupos tratados con epinastina y de control se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Las duraciones de la iniciación del vuelo se magnifican en los recuadros (borde azul discontinuo). Los números en las barras indican los tamaños de las muestras.

No ha habido informes previos sobre los niveles de dopamina en el cerebro de los zánganos de las abejas melíferas durante la etapa de pupa, por lo que determinamos los niveles de sustancias relacionadas con la dopamina en los cerebros de las pupas de los zánganos. Los cambios en los niveles de dos precursores de dopamina (tirosina y DOPA) y dopamina exhibieron tendencias similares y dependieron de la edad durante la etapa de pupa (Fig. 7A, B, C). Los niveles de estas sustancias aumentaron significativamente con la edad y alcanzaron su punto máximo justo antes de la emergencia (P10-11), luego disminuyeron con la emergencia del adulto (tirosina: Kruskal-Wallis: H = 38,542, df = 5, P < 0,001; Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 7A, DOPA: H = 35,346, df = 5, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, Fig. 7B, dopamina: H = 51,459, df = 5, P < 0,001, Steel-Dwass: P < 0,05, figura 7C). Se informó un pico de dopamina alrededor de los 8 días de edad en zánganos adultos en la abeja melífera22, por lo que parecía que los niveles de dopamina en el cerebro tenían dos picos desde la pupa hasta la etapa adulta.

Cambios dependientes de la edad en las sustancias relacionadas con la dopamina normalizadas por la proteína cerebral en los zánganos de las abejas melíferas durante la etapa de pupa. Se muestran los cambios en los niveles de tirosina (A), los niveles de DOPA (B) y los niveles de dopamina (C). Las barras de error indican errores estándar. Las diferencias significativas según la prueba de Steel-Dwass (P < 0,05) se indican con letras diferentes. Los tamaños de las muestras se muestran entre paréntesis debajo de la edad.

Se ha requerido la investigación de los mecanismos fisiológicos que subyacen en el comportamiento reproductivo masculino para las especies del clado monofilético, como las abejas corbiculadas. En los zánganos de las abejas melíferas, se ha investigado la modulación del comportamiento reproductivo por aminas biogénicas8,10,23. Sin embargo, no ha habido informes previos de los niveles de aminas biogénicas en el cerebro y ensayos de comportamiento mediante la aplicación de aminas biogénicas en machos de abejorros. El presente estudio es la primera determinación de las funciones de la dopamina y la octopamina en las actividades conductuales de los machos en una abeja eusocial primitiva.

En machos de abejorros, el nivel de octopamina en el cerebro aumentó desde la pupa media hasta la etapa adulta. Las actividades locomotoras y de vuelo en los machos adultos también aumentaron con la edad hasta la edad de madurez sexual (8 días). Estos resultados sugieren que la octopamina es una sustancia neuroactiva potencial que coincide con los aumentos relacionados con la edad en las actividades conductuales. Luego probamos los efectos de las aminas biogénicas en las actividades conductuales mediante la inyección de drogas. La inyección de octopamina aumentó la actividad locomotora, mientras que la epinastina disminuyó la actividad locomotora y aumentó la latencia del inicio del vuelo. Dado que la epinastina actúa a través de los receptores de octopamina como antagonista, los resultados indican que el bloqueo de la señalización octopaminergica disminuye las actividades locomotoras y de vuelo, y por lo tanto, la octopamina potencia estas actividades en los abejorros machos. En los zánganos de las abejas melíferas, los niveles cerebrales de octopamina y las actividades locomotoras y de vuelo aumentaron con la edad10,23. La inyección de octopamina mejoró la actividad de vuelo en drones23. Los cambios en los niveles de octopamina y las funciones conductuales de la octopamina se han compartido entre machos de abejorros y zánganos de abejas melíferas.

A diferencia de la octopamina, los niveles de dopamina en el cerebro durante la etapa adulta disminuyeron inmediatamente después de la emergencia del adulto y la inyección de dopamina no afectó las actividades conductuales en los abejorros machos. Estos resultados sugieren que la dopamina no está implicada en el aumento de las actividades conductuales de los abejorros machos al menos en el día 4 de vida adulta.

Determinamos los cambios en los niveles de dopamina en los cerebros de los zánganos de las abejas melíferas durante las etapas de pupa para compararlos con los de los abejorros machos. Los niveles de dopamina en las pupas de las abejas melíferas aumentaron con la edad y alcanzaron su punto máximo inmediatamente antes de la emergencia de los adultos (P10-11). Anteriormente se informó que los niveles de dopamina durante la etapa adulta aumentaron con la edad y alcanzaron su punto máximo 8 días después de la emergencia10,22. Por lo tanto, los niveles de dopamina en los cerebros de los zánganos de las abejas melíferas tuvieron dos picos desde la pupa hasta la etapa adulta (Fig. 8, línea roja). En contraste con los dos picos en los niveles de dopamina en los zánganos de las abejas melíferas, los niveles de dopamina en los abejorros machos solo alcanzaron su punto máximo una vez desde la pupa media hasta las etapas adultas tempranas (Fig. 8, línea azul). Esta diferencia en los cambios en el nivel de dopamina durante la etapa adulta entre estas dos especies puede proporcionar una visión importante del proceso evolutivo de un ancestro común a dos especies. En los zánganos de las abejas melíferas, la dopamina mejora las actividades locomotoras y de vuelo10,23, que corresponden a un pico en el nivel de dopamina a la edad sexualmente madura (A8). En insectos solitarios, la dopamina mejora la actividad locomotora y el comportamiento sexual en D. melanogaster29,30,31, así como las actividades locomotoras y de vuelo en la gran abeja carpintera, X. appendiculata24. Estos resultados sugieren que los efectos de la dopamina sobre las actividades locomotoras y de vuelo podrían compartirse entre los machos de varias especies solitarias y la abeja melífera, pero no en el abejorro. Se requiere determinar si la característica ancestral es uno o dos picos de dopamina desde la pupa hasta la etapa adulta sexualmente madura.

Comparación de los cambios en los niveles de dopamina en el cerebro de abejas melíferas y machos de abejorros. Las líneas rojas y azules indican los niveles de dopamina en la abeja melífera (Apis mellifera) y el abejorro (Bombus ignitus), respectivamente. Los datos de dopamina para la abeja melífera se obtuvieron en el presente estudio y en los estudios de Harano et al.22 y Watanabe y Sasaki32.

Los efectos de la dopamina en las actividades locomotoras y de vuelo en los abejorros machos pueden haberse perdido o no se han utilizado debido a la falta de un pico de dopamina durante la etapa adulta. En los zánganos de las abejas melíferas, el pico de dopamina en la etapa adulta temprana se genera por los efectos de la hormona juvenil (JH) y la ingesta de alimentos8. El título de JH en la hemolinfa aumenta con la edad hasta la maduración sexual al igual que los niveles de dopamina en el cerebro22,33,34. JH mejora la expresión génica de enzimas involucradas en la biosíntesis de dopamina y aumenta los niveles de dopamina en el cerebro22,23,32,35. En machos de abejorros, el título de JH puede no aumentar durante la etapa adulta temprana y no estimular la biosíntesis de dopamina. La ingesta de alimentos que contienen tirosina de las abejas nodrizas también puede mejorar la expresión génica de las enzimas de la biosíntesis de dopamina y aumenta los niveles de dopamina durante la etapa adulta temprana en los zánganos de las abejas melíferas32,36. Los machos adultos del abejorro no reciben alimentos de los trabajadores y pueden tener menos oportunidades de ingerir tirosina que los zánganos de las abejas melíferas. Esta puede ser otra razón de la falta de aumento de la dopamina.

Este estudio investigó las relaciones entre las aminas biogénicas y el comportamiento reproductivo de los machos de abejorros (B. ignitus). También comparamos los mecanismos asociados en el abejorro y la abeja melífera para obtener información sobre la evolución de la regulación del comportamiento reproductivo. El nivel de octopamina en el cerebro aumentó con la edad en adultos en paralelo con las actividades locomotoras y de vuelo y la preferencia por la luz, mientras que el nivel de dopamina no lo hizo. La inyección de octopamina y epinastina afectó las actividades locomotoras y de vuelo de manera opuesta, pero no la dopamina. Estos resultados sugieren que el sistema octopaminérgico mejora las actividades locomotoras y de vuelo involucradas en el comportamiento reproductivo de los abejorros machos. Se ha informado que la dopamina y la octopamina promueven la actividad de vuelo de los zánganos de las abejas melíferas. Por lo tanto, la función de la octopamina en la promoción del vuelo se ha compartido entre los machos de abejorros y abejas melíferas, pero la función conductual de la dopamina con el aumento de dopamina no se observó en los machos de abejorros.

Colonias de abejorros (B. ignitus) criadas comercialmente se mantuvieron en cajas de madera siguiendo el procedimiento descrito por Sasaki et al.37,38. Se recogieron pupas macho de capullos en 12 colonias Queenright. Para identificar la edad de la pupa, definimos una pupa masculina blanca con ojos compuestos blancos como una pupa de 0–1 día (P0–1). Transferimos pupas de 0–1 día de edad a vasos de plástico (Φ98 mm × 96 mm) mantenidos a 28 °C en condiciones de oscuridad constante, y luego las recolectamos en 0–1, 2–3, 4–5, 6–7, y 8–9 días después de la pupa. Machos adultos recién emergidos (machos de 0 días de edad) fueron marcados en el tórax con pintura (Paint Marker, Mitsubishi, Japón) para identificar su edad. Los machos marcados se devolvieron a las colonias madre y se recolectaron de las colonias a una edad específica. Los machos recolectados se usaron para medir los niveles de aminas biogénicas en el cerebro y para experimentos de comportamiento. Las muestras utilizadas para medir los niveles de aminas biogénicas se recolectaron entre las 11:00 y las 13:30. Se sacrificaron con nitrógeno líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su análisis.

Las pupas y los adultos recién emergidos de abejas melíferas (A. mellifera) se obtuvieron de colonias normales de Queenright mantenidas en un colmenar en la Universidad de Tamagawa, Tokio, Japón. Para obtener pupas de zánganos, se introdujeron marcos de panales con áreas iguales de bases de panales de zánganos y obreras en las colonias para permitir que los trabajadores construyeran celdas de panales sobre ellas. Después de tapar las células de peine de zánganos, se tomaron los marcos de las colonias y se transfirieron a una incubadora mantenida a 33 °C. La edad pupal se identificó con base en el método descrito por Jay39. Los adultos recién emergidos también se recolectaron de las celdas de peine de zánganos. Las pupas y los zánganos adultos recién emergidos se recolectaron entre las 11:00 y las 13:30, se sacrificaron con nitrógeno líquido y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se midieron las sustancias relacionadas con la dopamina.

Se diseccionaron cabezas de abejorros y abejas melíferas almacenadas en nitrógeno líquido en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0) en una unidad de refrigeración Peltier (Kenis Ltd, Osaka, Japón) a aproximadamente 4 °C bajo un microscopio. Los cerebros disecados se homogeneizaron durante 2 min con homogeneizadores de microvidrio en 100 µl de ácido perclórico 0,1 M enfriado con hielo que contenía 0,1 ng/µl de 3,4-dihidroxibencilamina. Luego, cada muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se centrifugó a 15 000 × g y 4 °C durante 30 min. Cada sobrenadante se transfirió a microviales para su análisis mediante sistemas HPLC-ECD.

El sistema HPLC-ECD utilizado para medir los niveles de dopamina, octopamina y tiramina desarrollado por Sasaki et al.40 comprendía una bomba de suministro de solvente (PU-4180, Jasco, Tokio, Japón), un inyector automático refrigerado (AS-4050, Jasco) , y columna de fase reversa C18 (250 mm × 4,6 mm de d.i., tamaño de partícula promedio de 5 µm; UG120, Osaka Soda, Osaka, Japón), y la temperatura se mantuvo a 35 °C. El ECD (ECD-700, EICOM, Kioto, Japón) se fijó en 0,85 V y se empleó a 35 °C. La fase móvil contenía ácido monocloroacético 0,18 M y 2Na-EDTA 40 μM, que se ajustó a pH 3,6 con NaOH, ya esta solución se le añadió 1-octanosulfonato de sodio 1,62 mM y CH3CN al 5 %. El caudal se mantuvo constante a 0,7 ml/min.

El sistema HPLC-ECD utilizado para medir los niveles de tirosina y 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) desarrollado por Matsuyama et al.41 constaba de una bomba de suministro de disolvente (AS-4580, Jasco), un inyector automático refrigerado (AS-4550, Jasco) , y columna de fase reversa C18 (250 mm × 4,6 mm de d.i., tamaño de partícula promedio de 5 µm; MG, Osaka Soda), y la temperatura se mantuvo a 35 °C. El ECD (ECD-700, EICOM) se fijó en 0,84 V y se usó a 35 °C. La fase móvil contenía monohidrato de ácido cítrico 83 mM, acetato de sodio 17 mM, 2Na-EDTA 13 µM y 1-octanosulfonato de sodio 2,3 mM, y se añadió metanol al 7% a esta solución. El caudal se mantuvo constante a 0,7 ml/min. En ambos sistemas de HPLC-ECD, se analizaron estándares externos antes y después de los análisis de muestras para identificar y cuantificar las aminas biogénicas. Los picos se identificaron comparando el tiempo de retención y los voltamogramas hidrodinámicos con los obtenidos para los estándares. Las mediciones basadas en las áreas de los picos en los cromatogramas se obtuvieron calculando la proporción del área de los picos de una sustancia en relación con el área de los picos del estándar.

Para normalizar los niveles de aminas biogénicas en función del contenido de proteína en el cerebro, se midieron las cantidades de proteína utilizando el método de Bradford42. El sedimento de proteína precipitado obtenido del tejido cerebral después de extraer las aminas biogénicas se trató con los mismos procedimientos descritos por Sasaki et al.40. La absorbancia de cada muestra reaccionada se midió a una longitud de onda de 590 nm utilizando un lector de microplacas (MPR-A100, AS ONE, Osaka, Japón).

Los machos recolectados de las colonias madre se transfirieron individualmente a una cámara en forma de anillo (diámetro exterior 150 mm; diámetro interior 90 mm) con una cubierta de lámina transparente a 28 °C hasta el experimento de comportamiento (Fig. S4). Los experimentos conductuales se realizaron según lo descrito por Sasaki et al.43. La hoja de cubierta transparente se separó en cuatro divisiones mediante retículas y luego se cubrió con una hoja de plástico roja sobre la mitad de la cubierta transparente para proporcionar un área oscura (roja) para los insectos en la cámara. Después de la aclimatación durante 5 min, la actividad locomotora espontánea de cada abeja se registró con una cámara de video digital durante 15 min. El número de cruces de la cruz se contó en la grabación de datos de video. Además, se contaron los individuos que no se movían y los que caminaban. Se registró la duración de residir bajo la lámina de plástico roja para determinar la preferencia por la luz. Después de medir la actividad locomotora y las preferencias lumínicas, se midió la latencia de iniciación del vuelo en una jaula de red (45 cm × 60 cm × 45 cm) a 28 °C, como lo describen Sasaki et al.43 (Fig. S4). La cámara que contenía un macho se cubrió por completo con una lámina de plástico rojo y se transfirió a la jaula de red. Luego se quitó la sábana roja para permitir que el macho volara espontáneamente. El comportamiento de vuelo durante la observación durante 5 minutos después de quitar la hoja roja se clasificó según dos niveles como "no volador" (incluido el aleteo) y "volador". Se registró la latencia de iniciación del vuelo para los individuos "voladores".

Se disolvieron dos µl de solución de dopamina (Sigma-Aldrich) y octopamina (Sigma-Aldrich) (10–4, 10–3 y 10–2 M) en tampón de fosfato 0,1 M (pH 7,0) o 2 µl de fosfato 0,1 M tampón (control). Se disolvió epinastina (TCI, Tokio, Japón, antagonista del receptor de octopamina44,45) en tampón de fosfato 0,1 M a una concentración de 10–2 M. Examinar las funciones de las aminas biogénicas en la locomoción, la preferencia por la luz y los comportamientos de vuelo de los abejorros machos, las soluciones preparadas se inyectaron en el abdomen de machos de 4 días de edad usando una microjeringa de 10 µL con una aguja fina. La duración de la aclimatación fue de 15 min después de la inyección del fármaco antes de observar las actividades locomotoras.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software R (ver. 4.1.2, https://cran.r-project.org/). Los niveles de aminas biogénicas se compararon entre grupos utilizando la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Steel-Dwass para comparaciones por pares. Las actividades locomotoras y la duración de la residencia en el área roja también se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Steel-Dwass. Se examinaron las proporciones de las actividades locomotoras ("no moverse" frente a "caminar") y de vuelo ("no volar" frente a "volar") utilizando la prueba exacta de Fisher con la corrección de Bonferroni. Las actividades conductuales de los machos se examinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Steel (control frente a tratamientos). Las actividades conductuales de los hombres tratados con o sin epinastina se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney.

Todos los datos utilizados en el estudio actual están disponibles en el documento y sus materiales complementarios.

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Descargar referencias

Este estudio fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI [Números de concesión JP20K06077] a KS.

Escuela de Graduados en Agricultura, Universidad de Tamagawa, Machida, Tokio, 194-8610, Japón

Tomohiro Watanabe y Ken Sasaki

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KS y TW concibieron el estudio. KS y TW diseñaron los experimentos. TW realizó los experimentos. KS y TW analizaron los datos. TW escribió el texto principal del manuscrito y KS revisó y editó el manuscrito.

Correspondencia a Ken Sasaki.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Watanabe, T., Sasaki, K. Funciones conductuales de las aminas biogénicas en machos de abejorros. Informe científico 12, 20946 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7

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Recibido: 20 Septiembre 2022

Aceptado: 02 diciembre 2022

Publicado: 05 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25656-7

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