La función y la evolución de un interruptor genético que controla la diferenciación ocular con dimorfismo sexual en las abejas

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 463 (2023) Citar este artículo

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Los animales desarrollan estructuras morfológicas específicas del sexo que son diversas entre organismos. Sin embargo, la comprensión de los mecanismos evolutivos y de desarrollo que gobiernan estos rasgos aún es limitada y se restringe en gran medida a los genes del dominio DM, que son reguladores del desarrollo específicos del sexo conservados identificados en modelos genéticos. Aquí, informamos sobre un gen regulador del desarrollo específico del sexo, glubschauge (glu) que regula selectivamente la diferenciación ocular con dimorfismo sexual en las abejas. Descubrimos que el feminizador del gen de determinación del sexo (fem) controla el empalme específico del sexo de las transcripciones de glu, estableciendo un cambio genético en el que las proteínas Glu con un dominio de dedo de zinc (ZnF) solo se expresan en mujeres. Mostramos que la secuencia de codificación femenina era esencial y suficiente para la feminización parcial. Los estudios comparativos de secuencias y funcionales revelaron que el origen evolutivo del cambio genético fue seguido por el origen mutacional del dominio ZnF esencial. Nuestros resultados demuestran que glu es un cambio genético específico del sexo recientemente desarrollado para la regulación específica de la región de un carácter dimórfico.

Las diferencias morfológicas entre machos y hembras son muy comunes en los organismos animales. El desarrollo de tal dimorfismo sexual mejora directa o indirectamente la aptitud del portador. Los cuernos exagerados de algunos escarabajos y el patrón de color y el tamaño de la cola del pavo real brindan ejemplos intrigantes de tales estructuras sexualmente dimórficas. La aparición evolutiva de nuevas características sexuales en diferentes linajes animales establece notables diferencias entre organismos. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre los mecanismos evolutivos y de desarrollo molecular que gobiernan el dimorfismo sexual aún es limitado. Esto se debe en parte a que el trabajo se ha centrado en un número limitado de rasgos de dimorfismo sexual y se han realizado búsquedas sistemáticas de reguladores del desarrollo en muy pocos modelos genéticos.

La determinación del sexo establece una señal binaria que generalmente se transduce a través de una cascada de genes a reguladores del desarrollo controlados específicamente por sexo responsables de mediar aspectos de la diferenciación sexual1,2,3. En los vertebrados, la vía de determinación del sexo determina el sexo de la gónada. Las gónadas producen hormonas sexuales que regulan el destino sexual de los tejidos no gonadales. En los invertebrados, la señal primaria de determinación del sexo se traduce en reguladores del desarrollo que son factores de transcripción. El resultado es una decisión puramente celular autónoma pero coordinada sobre el destino sexual. Un regulador clave del desarrollo del dimorfismo sexual en los invertebrados es el gen del dominio DM1,2,4. Este gen codifica un factor de transcripción de tipo dominio DM con un dominio de unión a ADN tipo dedo de zinc entrelazado y está implicado en la especificación de órganos reproductivos1,5. Los dimorfismos sexuales regulados por los genes del dominio DM en otras partes del cuerpo son la morfogénesis de la cola masculina en Caenorhabditis elegans6,7, la antena específica masculina y el gancho torácico copulador en el crustáceo Daphnia magna8, peines sexuales en las patas delanteras masculinas en Drosophila melanogaster9,10, dimorfismo sexual estructuras córneas exageradas en algunos escarabajos11,12,13 y otras características4,14,15,16,17,18. Una característica general que surge de estos estudios es que los genes del dominio DM son reguladores del desarrollo que funcionan como interruptores genéticos específicos del sexo, ya que proporcionan actividad limitada a un sexo (estados de actividad ON u OFF) o distinta entre los sexos. Las pantallas sistemáticas revelaron que el gen doublesex (dsx) (que es uno de los genes del dominio DM en insectos) es el principal regulador del desarrollo de la diferenciación sexual en D. melanogaster, ya que especifica casi todas las características de dimorfismo sexual en esta especie19,20. Sin embargo, se desconoce en gran medida cómo se regulan otras características sexualmente dimórficas.

Nuestro trabajo previo sugirió que, además de los órganos reproductivos, las características externas de dimorfismo sexual de la abeja melífera Apis mellifera no están especificadas por el gen dsx21. Estas características incluyen los ojos compuestos que son aproximadamente cuatro veces más grandes en los machos que en las hembras (ver fenotipos de tipo salvaje (wt) en la Fig. 1A complementaria), lo que probablemente sea una adaptación para detectar machos y reinas durante su vuelo de apareamiento22,23,24. Las medidas cuantitativas del tamaño de los ojos en mutantes con pérdida de función dsx mostraron que el gen dsx no es necesario para el desarrollo del ojo con dimorfismo sexual (Fig. 1B complementaria).

Este conocimiento nos motivó a buscar sistemáticamente otro regulador del desarrollo específico del sexo. Queríamos probar la función de dimorfismo sexual y examinar el origen evolutivo de este otro regulador con el objetivo de comprender profundamente el mecanismo evolutivo y de desarrollo que subyace a la formación del rasgo de dimorfismo sexual. Identificamos un gen que especifica selectivamente la diferenciación ocular con dimorfismo sexual y lo llamamos glubschauge (glu). El gen funciona como un interruptor genético específico del sexo, ya que proporciona distintas actividades en mujeres y hombres. Solo las transcripciones específicas para mujeres codifican una proteína con un dedo de zinc (ZnF). Además, demostramos que la secuencia de codificación específica de la hembra es esencial y suficiente para la feminización parcial de toda la estructura. La secuencia evolutiva comparativa y los estudios funcionales revelaron que el gen fue reclutado recientemente para la vía de determinación del sexo, que fue seguida por la ganancia evolutiva del motivo ZnF esencial. Nuestros resultados muestran que glu es un regulador del desarrollo específico del sexo recién evolucionado que controla el dimorfismo sexual de una sola estructura, el ojo compuesto. Juntos, estos hallazgos sugieren un control específico de la región en el que las características de dimorfismo sexual en diferentes partes del cuerpo son instruidas por diferentes reguladores del desarrollo específicos del sexo, glu y dsx.

Para identificar un regulador del desarrollo sexualmente dimórfico que no sea el gen dsx, buscamos transcripciones empalmadas específicas de sexo. En las abejas, el genotipo heterocigoto u homocigoto/hemicigoto del gen determinante del sexo complementario (csd) es la principal señal de determinación del sexo (Fig. 1a). El gen csd regula el empalme específico femenino y masculino del transcrito feminizador (fem) generando una proteína Fem funcional solo en las mujeres25,26. El gen fem controla así todo el desarrollo de las hembras o los machos25,26. La proteína Fem expresada en las hembras dirige al menos el empalme específico de la hembra de las transcripciones del gen regulador del desarrollo, dsx, que especifica el desarrollo de las gónadas (Fig. 1a)21. La variante de empalme macho de la transcripción fem se produce por defecto25,26. Realizamos la secuenciación del transcriptoma embrionario femenino y masculino27 y buscamos uniones de empalme específicas del sexo que solo están presentes en las mujeres pero no en los hombres (Fig. 1b). Estas transcripciones posiblemente estén reguladas por la proteína Fem, que es un ortólogo de la proteína Transformadora en Drosophila25,26. Descubrimos que las transcripciones del gen glubschauge (glu, ID de gen 552468) se empalman específicamente por sexo, por lo que las proteínas con un motivo de dedo de zinc solo se pueden expresar en mujeres.

a Un modelo de la vía de determinación del sexo con el gen dsx como un regulador del desarrollo específico del sexo de la diferenciación de los órganos reproductivos. Las proteínas, así como el empalme específico del sexo de las transcripciones, se presentan esquemáticamente. A y B son variantes de proteínas derivadas de diferentes alelos csd. Los diferentes colores indican exones y proteínas que se empalman o expresan de forma específica para el sexo. csd: gen determinante del sexo complementario. fem: gen feminizador. b La estrategia experimental empleada para identificar otros reguladores del desarrollo que son específicos del sexo empalmados y regulados por el gen fem. El análisis del transcriptoma en embriones identificó transcritos empalmados específicos de sexo. El análisis de la secuencia codificante identificó posibles dominios de unión al ADN.

Mapeamos las lecturas de RNA-seq y las secuencias de amplicón de RT-PCR de embriones y adultos masculinos y femeninos a la secuencia genómica y descubrimos que el gen glu consta de 10 exones (Fig. 2a). Las transcripciones se transcriben desde dos sitios de inicio transcripcional (Fig. 2a, b) y se empalman alternativamente, lo que sugiere que se utilizan al menos tres posibles sitios de inicio de traducción en los exones 2, 3 y 4. Los sitios aceptores de empalme en el exón 8 son específicos del sexo, lo que conduce a un cambio en el marco de lectura abierto del exón 8 (ORF; Fig. 2c). Por lo tanto, los transcritos pueden expresar variantes de proteínas específicas para hombres y mujeres, que han compartido secuencias de aminoácidos N-terminal y C-terminal específicas para el sexo. La región compartida tiene una longitud de 210 a 316 aminoácidos. La parte específica de la mujer de la proteína consta de 1256 aminoácidos y alberga un motivo ZnF del tipo CCHH, que representa un posible dominio de unión al ADN28. La región específica masculina tiene solo 16 aminoácidos de longitud. Concluimos que el gen glu puede expresar proteínas con un dominio ZnF específicamente en mujeres, que está ausente en hombres. No se predijeron motivos conservados distintos del dominio ZnF en las proteínas Glu.

a Esquema de la organización genómica del gen glu. Las flechas rojas y los números sobre la estructura del genoma indican los sitios de destino de los sgRNA utilizados para la mutagénesis CRISPR/Cas9. b Transcripciones y proteínas específicas de mujeres y hombres. Los recuadros indican los exones. Las partes específicas para mujeres del ORF se muestran en rojo, las partes específicas para hombres se muestran en azul y las partes comunes se muestran en gris oscuro. La posición del motivo de dedo de zinc CCHH (ZnF) se indica en amarillo. c El límite de los exones 7 y 8, que está empalmado específicamente por sexo. Se muestran la secuencia de nucleótidos codificantes del ARNm y los aminoácidos codificados.

Para determinar si el gen glu está controlado por el gen fem, introdujimos codones de parada en el gen fem y estudiamos el empalme sexual de las transcripciones de glu. Los primeros codones de terminación se introdujeron a través de mutaciones de cambio de marco en el exón 3 y ambos alelos (Fig. 2 complementaria) utilizando el método CRISPR/Cas929 y el enfoque de mutación somática eficiente21. Estas mutaciones fem -/- imitan el estado regulador masculino (Fig. 1a)26. Examinamos individuos mutantes sin mosaicismo21, que identificamos mediante la secuenciación profunda de los amplicones para cada individuo (Tabla complementaria 1). Confirmamos que la mutación fem -/- era una mutación de pérdida de función al detectar solo la transcripción dsx masculina en mujeres genéticas (Fig. 3a y Tabla complementaria 2). En estas hembras fem -/-, solo se detectó la variante de empalme glu masculino, mientras que en las hembras de tipo salvaje, solo se encontró la transcripción glu femenina (Fig. 3a). Este cambio en el empalme demuestra que el gen fem controla directa o indirectamente el empalme femenino de las transcripciones de glu.

a Empalme específico de sexo de transcritos de glu en respuesta a mutaciones fem -/-. Se analizaron larvas hembra de estadio 1 individuales. Panel superior: amplicones resueltos por tamaño de las RT-PCR, que se ajustaron semicuantitativamente entre individuos usando transcripciones de ef-1α (ef1α, factor de elongación 1α) como referencia. Los fragmentos de glu específicos de hembra (gluF) y macho (gluM) se amplificaron con un único par de cebadores. Tabla: El número de individuos en los que se examinó gluF. Las transcripciones de gluM mostraron una baja abundancia y se amplificaron de manera inconsistente en los mutantes. gluADN: ADN. b El empalme glu en mutantes femeninos dsx stop/stop y el empalme dsx en mutantes femeninos glu ∆ex2-8/∆ex2-8. Se agruparon y analizaron las antenas de 4 a 5 pupas o adultos. wt: controles de tipo salvaje. C: control negativo para PCR.

Para comprender mejor si glu y dsx son genes que operan en paralelo bajo el control del gen fem, estudiamos el empalme glu en mutantes con pérdida de función dsx y el empalme dsx en mutantes con pérdida de función glu. Nuevamente, se generaron mutaciones bialélicas para el gen dsx en mujeres (dsx stop/stop)21 y el gen glu (glu ∆ex2-8/∆ex2-8; sgRNA 1 y 3) utilizando el método CRSPR/Cas9. Observamos que la falta de actividad dsx no afecta el empalme de glu (Fig. 3b). Además, la falta de actividad glu no influye en el empalme dsx (Fig. 3b). Estos resultados mostraron que el empalme de la transcripción de glu no depende de la actividad de dsx y que el empalme de la transcripción de dsx no requiere actividad de glu. Concluimos que dsx y glu son dos genes controlados específicos del sexo, que operan en ramas paralelas de la vía determinante del sexo bajo el control del gen fem.

Para determinar si la transcripción masculina es el estado regulador predeterminado, que no depende de la entrada del gen fem, estudiamos el empalme de glu en diferentes etapas embrionarias antes y después del inicio de la vía de determinación del sexo26,30. En embriones de 0 a 15 horas, detectamos solo una variante que es específica de macho en etapas posteriores (Fig. 4a). A partir de las 25 h, con el inicio de la vía de determinación del sexo y el empalme alternativo de los transcritos fem después de 24-39 h en la etapa de blastodermo celular26,30, el gen glu mostró un empalme específico de hembra. La transcripción específica de macho es el estado regulador predeterminado que cambia al estado determinado por hembra a través del empalme mediado por proteína Fem. Colectivamente, estos resultados establecen que el gen glu opera como un interruptor genético con dos estados de actividad a través del empalme de transcritos específico del sexo. Estas transcripciones pueden expresar diferentes actividades proteicas en hembras y machos.

a Transcripciones de glu específicas del sexo en diferentes etapas embrionarias: celularización e inicio del blastodermo (0–15 h después de la puesta de huevos), final del blastodermo y etapa de gastrulación (25–40 h) y finalización larval (55–70 h)69. Se realizó una RT-PCR semicuantitativa en grupos de embriones. b Expresión específica de tejido de gluF en machos y hembras en el estadio pupal 4 y en machos y hembras adultos de 10 días de edad. Los resultados de la RT-PCR semicuantitativa se ajustaron entre las muestras utilizando los niveles de transcripción de ef1α como referencia. La muestra de abdomen no contiene gónadas y ganglios. Se realizaron tres réplicas biológicas. Las transcripciones de gluM en pupas y adultos no se amplificaron (Fig. 4 complementaria). F: hembra; M: masculino; ef1α: factor de elongación 1α; C: control negativo para PCR.

A continuación, examinamos si el gen glu se transcribió específicamente en el tejido, lo que indicaría una expresión específica de la región del gen glu controlada por la programación del desarrollo del patrón general del cuerpo. En la etapa de pupa del ojo rojo (etapa 4), detectamos de manera confiable las transcripciones de gluF (hembra) en el cerebro (incluidos los tejidos de los ojos complejos), las gónadas y las patas traseras entre las tres réplicas (Fig. 4b) pero no en el otro tejidos examinados. En hembras de abejas adultas, encontramos que gluF se expresaba en el cerebro, el abdomen, la antena y las patas traseras (Fig. 4b). Nunca detectamos la expresión de gluF en el tórax o la cápsula de la cabeza de las abejas adultas. Curiosamente, nunca pudimos amplificar de manera confiable la variante masculina en pupas y adultos (Figura 3 complementaria), lo que sugiere una ausencia de transcripciones masculinas. Llegamos a la conclusión de que la transcripción específica de macho representa un estado no activo del interruptor genético. Dado que las transcripciones de fem macho también faltan en las pupas26, es posible que los codones de parada tempranos induzcan una descomposición mediada por tonterías de las transcripciones gluM y femM específicas de macho31. En conjunto, estos resultados muestran que el gen glu es un interruptor genético específico de región y sexo, que puede proporcionar una actividad limitada a un solo sexo y esto en tejidos específicos.

Para comprender si el gen glu empalmado específicamente para el sexo es un regulador del desarrollo del dimorfismo sexual, mutamos glu en embriones femeninos usando el método CRISPR/Cas9, criamos larvas hasta la etapa de pupa con nutrición obrera y buscamos individuos no mosaicos en los que ambos los alelos se mutaron mediante secuenciación profunda de amplicones21,29. Las hembras genéticas homocigóticas para las deleciones del exón 2 al exón 8 (glu ∆ex2-8/∆ex2-8, sgRNA1 y 3) desarrollaron ojos más grandes con una extensión dorsal similar a la de los machos (puntas de flecha, Fig. 5a). La longitud y el ancho relativos de sus ojos compuestos fueron significativamente mayores, mientras que la distancia interocular relativa de sus ojos compuestos fue significativamente más corta en relación con las hembras de tipo salvaje (Fig. 5c). Estos resultados indican una pérdida parcial de las características femeninas y una ganancia parcial de las características masculinas. Otras características sexualmente dimórficas de la morfología del cuerpo externo y los órganos reproductivos (al nivel de la detección del microscopio estereoscópico) fueron las mismas que las de las hembras de tipo salvaje (Fig. 4 complementaria), lo que sugiere que la función de desarrollo general de gluF está restringida a la región del Ojo compuesto. Para comprender si el gen glu regula las características de desarrollo específicas de las hembras y no las generales, comprometimos específicamente la parte femenina limitada de la proteína. Introdujimos codones de parada en el exón 8 usando sgRNA 10 para que el motivo CCHH ZnF específico de hembra junto con los últimos 254 a 291 aminoácidos no se expresaran. Las hembras glu ex8stop/ex8stop mostraron el mismo fenotipo que las hembras glu ∆ex2-8/∆ex2-8 (no fueron significativamente diferentes), mientras que nuevamente encontramos los efectos en el ancho relativo del ojo, la longitud y la distancia interocular (Fig. 5a– C). Este resultado demuestra que las transcripciones de gluF codifican un regulador del desarrollo del desarrollo del ojo sexualmente dimórfico. A continuación, queríamos examinar si se requiere la transcripción de gluM para las características masculinas, a pesar de la falta de expresión en pupas y adultos masculinos. Sin embargo, no pudimos probar esta hipótesis, ya que la cría de machos de control de pupas ya falló (a pesar de una cantidad similar de huevos), lo que sugiere que nuestro procedimiento de crianza no se puede aplicar fácilmente a los machos.

a Morfología de la cabeza de mutantes glu ∆ex2-8/∆ex2-8 (n = 10) y glu ex8stop/ ex8stop (n = 5) hembra en el estadio pupal 4 (fase de ojos rojos). Las puntas de flecha marcan la extensión dorsal similar a la masculina del ojo compuesto. b Las mutaciones de ADN introducidas y los productos proteicos esperados se presentan esquemáticamente. c Ancho relativo de los ojos: ancho de los ojos en relación con el ancho de la cabeza. Longitud relativa del ojo: longitud del ojo en relación con la longitud de la cabeza. Distancia interocular relativa: distancia interocular relativa al ancho de la cabeza (prueba U de Mann-Whitney de dos colas). Se muestran las medias y las desviaciones estándar. d Presentación esquemática de la generación de la mutación glu ex7-8 F en machos. e Morfología de la cabeza de machos glu ex7-8 F feminizados (n = 9) en la etapa adulta. La punta de flecha marca una reducción del cierre dorsal en machos mutantes. f Diámetro de la faceta dorsal de la lente, prueba U de Mann-Whitney de dos colas. Se muestran las medias y las desviaciones estándar. wt: tipo salvaje.

Habiendo demostrado que la secuencia de codificación específica de la hembra es esencial, nos preguntamos a continuación si es suficiente para feminizar toda la estructura del ojo compuesto. Eliminamos la secuencia del intrón 7 y fusionamos las secuencias del exón 7/8 usando la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR/Cas9 para que las transcripciones de glu presentes en los machos codificaran solo proteínas Glu específicas de hembras (Fig. 5d, sgRNAs 3 y 7). Los ojos de estos machos glu ex7-8 F (haploides) eran más pequeños en la vista frontal (Fig. 5e), mientras que el cierre dorsal de los ojos era menos pronunciado (puntas de flecha, Fig. 5e), lo que indica un cambio parcial del macho. a la morfología del ojo femenino que afecta a toda la estructura del ojo. A continuación, preguntamos si las facetas dorsales de la lente de los ojos compuestos estaban feminizadas. Los tamaños de las facetas dorsales del cristalino en las abejas son extremadamente dimórficos sexualmente y contribuyen a la diferencia general de tamaño específica del sexo del ojo compuesto23,24. Las facetas masculinas más grandes muestran una mayor sensibilidad a la luz y representan una adaptación para detectar zánganos y reinas durante el vuelo de apareamiento del macho. Descubrimos que las facetas dorsales de la lente de los machos glu ex7-8 F estaban sustancialmente feminizadas (p <0.001, Fig. 5f) y casi mostraban un cambio completo en su tamaño en comparación con las hembras de tipo salvaje. Estos resultados sugieren que la secuencia de codificación glu ex7-8 F es suficiente para instruir una feminización de la morfología del ojo. Sin embargo, la feminización observada fue parcial, lo que sugiere que al menos otro gen también está involucrado en la diferenciación del ojo con dimorfismo sexual.

Los reguladores clave que dan forma a las características del desarrollo son a menudo factores de transcripción (TF) que regulan múltiples genes aguas abajo y características celulares terminales. Los TF se caracterizan por dominios de unión al ADN, como los dominios de dedos de zinc CCHH28,32,33. Para examinar si el motivo CCHH ZnF de Glu específico para mujeres es un elemento clave de un posible TF, alteramos las posiciones esenciales de este motivo34,35,36 y estudiamos su papel en el desarrollo del ojo sexualmente dimórfico. Anteriormente ha sido difícil determinar tales funciones de motivo en modelos no genéticos. Aquí, empleamos la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR/Cas9 para reemplazar los nucleótidos que codifican cisteína e histidina del motivo central ZnF con aquellos que codifican alanina (Fig. 6a) con el objetivo de interrumpir una posible estructura ZnF en mujeres37,38,39 . Los mutantes dobles homocigóticos (glu tmC2H2/tmC2H2) mostraron una longitud de ojo relativa significativamente mayor (p < 0,05), una distancia interocular algo más corta (p = 0,06) y el mismo ancho de ojo que los controles (Fig. 6b, c), lo que sugiere una función de este motivo en el desarrollo sexualmente dimórfico. Además, las hembras heterocigotas glu tmC2H2/ex8stop (con un alelo un alelo de pérdida de función) mostraron una mayor pérdida parcial de las características femeninas, representando un fenotipo intermedio entre las homocigotas glu tmC2H2/tmC2H2 y glu ∆ex2-8/∆ex2-8 mutantes (Fig. 6b, c). Estos resultados demuestran un papel del motivo CCHH en el desarrollo del ojo con dimorfismo sexual, lo que respalda la noción de que el gen glu codifica un factor de transcripción específico para mujeres. Sin embargo, el ancho de los ojos no se vio afectado por la mutación CCHH. Dado que los reguladores del desarrollo del tipo ZnF suelen tener más de un dominio ZnF28,36, a continuación preguntamos si las proteínas Glu femeninas contienen otros motivos ZnF. Encontramos otros tres posibles motivos ZnF del tipo no canónico ubicados alrededor del motivo CCHH ZnF (Fig. 5 complementaria), lo que indica la posibilidad de dominios de unión a ADN adicionales.

un esquema de las mutaciones tmC2H2 que se indujeron a través de la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR/Cas9. El motivo central CCHH ZnF C-X2−4-C-X12-H-X3−5-H34,35,36 se muestra junto con las secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes del tipo salvaje (wt) y el alelo tmC2H2. Las letras rojas indican codones y aminoácidos del motivo central CCHH. Las mutaciones silenciosas evitan que los sgRNA se unan más a sus sitios de destino. Secuencia subrayada: objetivos de sgRNA 10 y 9. C: cisteína, H: histidina, A: alanina. b Morfología ocular de hembras mutantes glu tmC2H2/tmC2H2 (n = 10) y glu tmC2H2/ex8stop (n = 6) en el estadio pupal 4. Se muestran los aminoácidos alrededor de las secuencias codificantes de ZnF. El módulo de dedos de zinc (ZnF) se resalta en amarillo, mientras que los cambios de aminoácidos inducidos del motivo central se muestran en rojo. c Tamaños relativos y posiciones de los ojos en los mutantes (prueba U de Mann-Whitney de una cola). Se muestran las medias y las desviaciones estándar.

Dado que la función de glu como un regulador del desarrollo específico del sexo de la diferenciación sexualmente dimórfica no se ha descrito en otras especies, examinamos si esta función ha evolucionado recientemente. Para obtener información sobre la historia evolutiva de este gen, primero examinamos la expresión específica del sexo de los homólogos de glu en especies derivadas de los principales linajes de insectos (Fig. 6 complementaria). En el insecto díptero D. melanogaster, el escarabajo Tribolium castaneum y el insecto hemíptero Cimex lectularius (chinche de cama), los homólogos de glu no se empalmaron ni transcribieron específicamente por sexo (Fig. 7a). Sin embargo, en la avispa joya himenóptera Nasonia vitripennis, las transcripciones del homólogo de glu (Nv-glu) se empalmaron específicamente por sexo con una transcripción específica de hembra y una transcripción común a hembras y machos (Fig. 7a y Fig. 6 complementaria) . A continuación, examinamos si este empalme específico del sexo en la avispa joya estaba controlado por el gen tra (que es el ortólogo del gen fem de la abeja). La eliminación del gen tra en hembras de N. vitripennis usando ARNi sistémico resultó en una reducción en la transcripción de Nv-glu específica de hembra y un gran aumento en la transcripción común en relación con los controles tratados con gfp dsRNA (Fig. 7b). Este resultado sugiere que el gen tra controla (directa o indirectamente) el corte y empalme específico de la hembra del ortólogo glu en N. vitripennis. Concluimos a partir de la inferencia de máxima parsimonia de estos resultados que el empalme específico de sexo de glu por fem/tra ha surgido evolutivamente en el linaje de insectos himenópteros.

a El control de empalme específico del sexo evolucionó en el linaje de los himenópteros. Empalme de ortólogos glu en D. melanogaster (CG12316), C. lectularius (LOC106661925), T. castaneum (LOC103312333) y N. vitripennis (Nv-glu). Se estudiaron las secuencias homólogas al exón 7/8 de la abeja. Los resultados semicuantitativos de la RT-PCR se ajustaron en tres réplicas biológicas usando transcripciones de ef1α (factor de elongación 1α) de C. lectularius (Cl-ef1α) y T. castaneum (Tc-ef1α) y la proteína ribosomal L38 de D. melanogaster (RPL38). Nv-gluF de N. vitripennis se empalma específicamente para hembras y codifica un péptido específico para hembras, mientras que Nv-gluC es común para ambos sexos. Nv-gluDNA es la secuencia genómica amplificada. b El empalme específico del sexo de Nv-glu en N. vitripennis está controlado por el gen tra. La caída del gen tra estuvo mediada por ARNi sistémico. dsRNA: ARN de doble cadena. Gfp: control dsRNA. Los resultados de la RT-PCR se ajustaron semicuantitativamente en tres grupos recolectados después de 3, 4 y 5 días (d) después del tratamiento usando transcritos de Nv-ef1α. C: control negativo para PCR. c El motivo CCHH ZnF específico de hembra se originó evolutivamente en insectos himenópteros. Alineación de secuencias de aminoácidos de homólogos de glu y relaciones filogenéticas de las especies correspondientes. En la figura complementaria 7 se muestran ejemplos representativos de los principales linajes evolutivos y 49 secuencias de himenópteros. Las relaciones filogenéticas y los tiempos de divergencia evolutiva siguen a Peters et al.70. Recuadros pequeños rojos: aminoácidos del motivo central; cajas grises: residuo de núcleo hidrofóbico; Valores % junto a los nodos: probabilidad inferida de cambios según el método de parsimonia. d El homólogo glu de N. vitripennis no está involucrado en la diferenciación ocular específica del sexo. Diferenciación ocular específica del sexo de machos y hembras de N. vitripennis en respuesta a la eliminación del gen Nv-glu a través del ARNi sistémico. Se presentan parámetros oculares absolutos en lugar de relativos, ya que las inyecciones de larvas y el tratamiento con dsRNA solo afectaron el tamaño general de la cabeza adulta (Fig. 9 complementaria). A modo de comparación, se proporcionan los valores absolutos y significativos de las abejas (Figura complementaria 10). Se muestran las medias y las desviaciones estándar.

Nuestros estudios mutacionales revelaron que el motivo CCHH ZnF específico de la hembra es un elemento clave de la diferenciación sexualmente dimórfica del ojo compuesto en las abejas. Para determinar si el motivo CCHH ZnF de novo se originó por reemplazos de aminoácidos (está, por ejemplo, ausente en D. melanogaster), inferimos la probabilidad de diferentes estados ancestrales de los aminoácidos utilizando el método de parsimonia máxima de un conjunto de glu secuencias homólogas de 49 especies de himenópteros. Los estados ancestrales identificados sugieren que el motivo CCHH ZnF se originó dentro del linaje Aculeata después de separarse del linaje de la avispa parasitoide, que incluye la avispa joya N. vitripennis (Fig. 7c y Fig. 7 complementaria). Descubrimos que el motivo CCHH ZnF evolucionó a través de una serie de cambios que podrían reconstruirse a partir de los estados ancestrales y la filogenia de las 49 secuencias (Fig. 7c y Fig. 7 complementaria). La secuencia de los cambios evolutivos fue la siguiente: (i) ganancia del espacio necesario entre la 2.ª cisteína y la 2.ª histidina mediante inserciones/deleciones; (ii) ganancia del aminoácido hidrofóbico isoleucina (I), un residuo central del motivo canónico, por mutación puntual28,36; y (iii) ganancia del aminoácido histidina (H), que completó el motivo CCHH ZnF. Estos resultados sugieren que el motivo CCHH ZnF evolucionó de novo a través de una serie de mutaciones en la secuencia codificante.

El homólogo de glu en D. melanogaster (CG12316) no está empalmado específicamente para el sexo y no tiene un fenotipo anotado40,41,42, lo que plantea la cuestión de si la función de glu como regulador del desarrollo específico del sexo ha evolucionado recientemente. Para obtener evidencia sobre el origen evolutivo de esta función, examinamos el papel de Nv-glu en N. vitripennis utilizando ARNi sistémico (Fig. 8 complementaria). Este estudio en N. vitripennis fue informativo en ese sentido, ya que Nv-glu puede representar un posible estado evolutivo intermedio del pasado, en el que se obtuvo empalme específico del sexo mientras aún faltaba un motivo CCHH ZnF. Además, se demostró previamente que la distancia interocular de machos y hembras presentaba dimorfismo sexual en N. vitripennis18. El ancho, el largo y las distancias intraoculares de los ojos compuestos no difirieron entre los individuos de Nv-glu knockdown y control, tanto en hembras como en machos (Fig. 7d). Estos resultados de los experimentos sistémicos de ARNi sugieren que el gen Nv-glu no controla la diferenciación ocular con dimorfismo sexual en la avispa joya. En conjunto, estos resultados comparativos nos llevaron a la conclusión de que el papel de glu como regulador del desarrollo ocular con dimorfismo sexual evolucionó recientemente en los insectos himenópteros y esto en el linaje que conduce a las abejas.

Un interés central de los biólogos del desarrollo es comprender cómo las señales de determinación del sexo se integran con el programa general de desarrollo. Este es un tema particularmente intrigante, ya que las diferencias entre los sexos pueden ser múltiples y los dimorfismos sexuales son asombrosamente diversos entre los organismos, lo que sugiere una rápida divergencia. Ahora hemos caracterizado con el gen glu otro regulador del desarrollo sexual y elucidado su mecanismo molecular de control, proporcionando una mayor comprensión de cómo se forman las estructuras sexualmente dimórficas.

Mostramos que la diferenciación ocular con dimorfismo sexual en las abejas está parcialmente regulada por el gen glu, un regulador del desarrollo específico del sexo que no se había informado anteriormente. El gen glu actúa como un interruptor genético específico del sexo (Fig. 8a). La actividad específica del sexo es proporcionada por el empalme de transcritos específicos de mujeres y hombres, que está controlado por el gen fem, un ortólogo del gen tra25,26. Las proteínas Fem, que se limitan a las mujeres, dirigen el uso de un sitio aceptor de corte y empalme alternativo en el exón 8. Estas transcripciones específicas de mujeres codifican proteínas GluF (1466 a 1572 aminoácidos) con dominios ZnF. En ausencia de proteínas Fem en los machos, se emplea otro sitio aceptor de corte y empalme en el exón 8, lo que produce un codón de parada temprano en las transcripciones de glu. La proteína masculina predicha sin dominio ZnF tiene una longitud de 226-332 aminoácidos. Sin embargo, la falta de transcripciones de glu en pupas y adultos machos sugiere que la transcripción empalmada masculina no tiene ninguna función. Posiblemente, esta falta de transcrito se deba al codón de parada temprano, que puede inducir la descomposición del transcrito mediada por tonterías31. De acuerdo con nuestros estudios funcionales, la regulación más obvia de este cambio genético es que la expresión de la proteína que contiene el dominio ZnF (GluF) específico de la hembra proporciona actividad exclusivamente en las hembras. Los transcritos masculinos producen una proteína no funcional o no producen proteína.

a Las funciones específicas de la región de los genes glu y dsx en la diferenciación sexualmente dimórfica de las abejas hembra. b La secuencia de los pasos evolutivos que dan lugar a un cambio genético para la diferenciación sexualmente dimórfica. Los recuadros indican los exones. Las partes específicas para mujeres del ORF se muestran en rojo, las partes específicas para hombres se muestran en azul y las partes comunes se muestran en gris oscuro. El motivo de dedos de zinc (ZnF) se indica en amarillo.

La proteína GluF es probablemente un factor de transcripción del tipo de dominio ZnF, que regula la feminización de la morfología del ojo (Fig. 8a). La diferenciación específica de los machos resulta del estado regulatorio predeterminado de este interruptor genético. Nuestros estudios mostraron un fenotipo intersexual con diferentes grados, lo que sugiere que gluF es solo parcialmente responsable de regular la estructura sexual general del ojo y es principalmente responsable del tamaño de la faceta del cristalino con dimorfismo sexual. Esto sugiere que otros genes regulados específicos del sexo deben estar involucrados en la configuración de la diferenciación del ojo con dimorfismo sexual. Estos podrían ser otros genes del desarrollo regulados sexualmente y/o genes con funciones generales como la proliferación celular, que pueden afectar el tamaño y la forma de los ojos. Se ha demostrado la proliferación de células madre específicas del sexo en Drosophila, que es responsable del tamaño más grande del órgano del intestino medio femenino43.

Estudios previos han demostrado que los genes del dominio DM son reguladores conservados centrales del desarrollo específico del sexo. Los homólogos del gen del dominio DM en diferentes filos animales instruyen la morfología sexual externa, como la morfología de la cola de C. elegans6,7, la antena específica del macho y el gancho torácico copulador del crustáceo D. magna8, los peines sexuales de D. melanogaster9,10 y las estructuras córneas exageradas de algunos escarabajos11,12,13. Los genes del dominio DM actúan como un interruptor genético específico del sexo que produce distintas actividades en machos y hembras. En los insectos, las actividades específicas del sexo se establecen a través del empalme. El empalme mediado por genes homólogos fem/tra conduce a la expresión de proteínas Dsx específicas del sexo con un dominio DM compartido pero extremos C diferentes en muchos insectos3,44,45.

Dos preguntas centrales han sido (i) cómo los genes del dominio DM pueden instruir estructuras específicas del sexo en diferentes partes del cuerpo y (ii) cómo los genes DM ampliamente conservados pueden instruir la formación de estructuras sexualmente dimórficas recientemente evolucionadas que antes estaban ausentes en un linaje animal. Se han sugerido dos mecanismos, que resultaron principalmente del trabajo centrado en el gen dsx en insectos y el género Drosophila2,10,12,46,47,48,49,50. Un mecanismo que explica las estructuras sexualmente dimórficas en diferentes partes del cuerpo sugiere que la expresión local del gen dsx proporciona la instrucción sexual específica de la región. Por ejemplo, los peines sexuales específicos de los machos están confinados a la pata delantera de Drosophila y son inducidos por la expresión local de dsx en ese tejido9,10. Un mecanismo que explica el origen evolutivo de un nuevo dimorfismo sexual sugiere que las ganancias y modificaciones evolutivas de los elementos reguladores cis de los genes diana dsx establecen regulaciones genéticas alteradas para nuevas características46,51. Por ejemplo, la extensión de la pigmentación del cuerpo abdominal en machos de D. melanogaster puede evolucionar a partir de ganancias y modificaciones evolutivas de estos elementos reguladores cis46,51.

Los resultados de nuestro estudio sobre glu ahora sugieren otros mecanismos subyacentes a la formación local y el origen evolutivo de un dimorfismo específico del sexo. Demostramos que glu en las abejas es un regulador del desarrollo específico del sexo recién evolucionado que se expresa de una manera específica del tejido y regula selectivamente la feminización del ojo (Fig. 8). En las abejas, dsx regula el desarrollo de los órganos reproductivos sexuales21 y no la diferenciación sexual de la cabeza o el ojo (Figura complementaria 1). Estos resultados sugieren un mecanismo en el que el dimorfismo sexual en distintas partes del cuerpo está regulado por diferentes reguladores del desarrollo específicos del sexo (glu y dsx). Operan en paralelo, pero en diferentes regiones del cuerpo a través de la expresión específica de tejido (Fig. 8a). Además, la evolución de la función de glu también proporcionó información sobre los mecanismos evolutivos que subyacen a un posible origen de una estructura sexualmente dimórfica. Mostramos que el origen evolutivo de la expresión específica del sexo (a través de la ganancia de empalme específico del sexo) más la ganancia de la función molecular (a través del origen de un motivo ZnF) condujo a un nuevo regulador del desarrollo específico del sexo para el dimorfismo sexual.

El origen de los rasgos de dimorfismo sexual sigue siendo un tema central en la biología evolutiva. Queda la pregunta de cómo podría originarse esta nueva regulación específica del sexo para las estructuras dimórficas. Los estudios funcionales y de secuencia comparativos del gen glu sugieren que esta función se originó en una secuencia y dos pasos (Fig. 8b). En el primer paso, se incorporó glu a la vía de determinación del sexo, que estableció el cambio genético y la expresión específicos del sexo. Demostramos esta ganancia de control específico del sexo a través del origen del control de empalme dependiente de fem sobre las transcripciones de glu, que posiblemente ocurrió después de la división del linaje de himenópteros de otros linajes de insectos importantes. En el segundo y siguiente paso, el gen glu ganó su función de diferenciación ocular específica del sexo dentro de los insectos himenópteros y esto en el linaje que conduce a la abeja (Fig. 8b). Anteriormente se demostró que dsx es responsable del patrón de la cabeza masculina y el tamaño de los ojos en el género Nasonia18, mientras que mostramos que glu no tiene influencia en el tamaño de los ojos en N. vitripennis. Además, al examinar la evolución y la función del motivo ZnF, demostramos que el papel de este dominio para la diferenciación ocular específica del sexo evolucionó nuevamente después de la obtención de la expresión específica del sexo.

La secuencia de estos cambios proporciona información sobre cómo se pueden originar nuevas estructuras sexualmente dimórficas durante la evolución. Observamos una secuencia de cambios evolutivos (ganancia de expresión específica del sexo seguida de un origen de la función de desarrollo específica del sexo), que la teoría ha predicho durante mucho tiempo, pero que nuestro conocimiento no ha demostrado52,53,54. Descubrimos que la ganancia evolutiva de la expresión específica del sexo de glu fue el paso inicial que limitó algunas mutaciones a la secuencia codificante de la proteína femenina. Además, demostramos que estas mutaciones en la secuencia de codificación femenina estaban involucradas en la formación de un nuevo motivo ZnF que tiene una función de desarrollo limitada a las mujeres. Por lo tanto, nuestros hallazgos demuestran que la ganancia de expresión específica del sexo es un camino molecular a través del cual se pueden originar evolutivamente nuevos reguladores del desarrollo para el dimorfismo sexual.

Las abejas utilizadas en este estudio procedían de colonias de Apis mellifera carnica salvajes. Se recolectaron embriones femeninos (que son diploides) de huevos puestos por reinas apareadas naturalmente. Se recolectaron huevos machos haploides de reinas no apareadas tratadas con CO2, que induce la puesta de huevos no fertilizados. Los embriones se recolectaron utilizando una caja de recolección de huevos Jenter (Jenter Queen Rearing Kit, Karl Jenter GmbH, Frickenhausen, Alemania) y se inyectaron o se dejaron en la incubadora a 34 °C hasta la etapa objetivo55. Se recolectaron pupas y adultos de tipo salvaje de colonias de abejas. Se adquirieron machos y hembras adultos de Cimex lectularius de tipo salvaje de Insect Services GmbH (Berlín, Alemania). Los adultos de Drosophila melanogaster de la cepa isogénica w1118 fueron un regalo de Hermann Aberle (Universidad Heinrich-Heine de Düsseldorf, Alemania). Los machos y hembras adultos de Tribolium castaneum fueron un regalo de Gregor Bucher (Universidad de Göttingen, Alemania). La cepa de laboratorio AsymCx de Nasonia vitripennis se curó de la infección por Wolbachia y se crió continuamente en Calliphora sp. huéspedes a 25 °C. Las avispas macho y hembra se separaron en función del tamaño de las alas delanteras específico del sexo antes de la eclosión. Se generó descendencia solo masculina al ofrecer anfitriones a hembras vírgenes. Para producir descendencia femenina, una hembra virgen se emparejó con un macho soltero y se le permitió aparearse durante un día. Se proporcionaron dos hosts por día a hembras individuales para iniciar la oviposición.

El ADN genómico se aisló de tejido de larva L1, pata de reina o pata trasera de pupa de abeja melífera con el kit innuPREP DNA Mini (Analytik Jena, Jena, Alemania). Se aisló ARN de tejido de abeja disecado y adultos de D. melanogaster, T. castaneum o C. lectularius (tres individuos combinados de cada sexo) mediante el método TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania). Se aisló el ARN del estadio larval 1, embriones o grupos de embriones utilizando el kit innuPREP DNA/RNA Mini (Analytik Jena, Jena, Alemania). El ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra RevertAid y oligo dT o cebadores de hexámeros aleatorios (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania). Posteriormente, la segunda hebra se sintetizó utilizando ADN polimerasa I21. La purificación de cDNA se realizó utilizando el kit EZNA Cycle Pure (Omega Bio-Tek. Inc., Norcross, EE. UU.). El ARN de N. vitripennis se extrajo utilizando ZR Tissue & Insect RNA MicroPrep™ (Zymo Research, Friburgo, Alemania) con tratamiento con DNasa I en columna (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania). En este caso, el ADNc se sintetizó utilizando el kit de síntesis de ADNc SensiFAST™ (Bioline, Londres, Inglaterra).

Se utilizó ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania) para la RT-PCR si los amplicones se iban a secuenciar posteriormente. De lo contrario, se utilizó GoTaq® G2 Flexi DNA Polymerase (Promega, Walldorf, Alemania). La PCR se realizó con un perfil de temperatura estándar56. Para la RT-PCR semicuantitativa, la cantidad de plantilla y el número de ciclos se ajustaron según el factor de elongación del gen de referencia 1-alfa (Nv-ef1α, N. vitripennis; Cl-ef1α, C. lectularius; ef1α, A. mellifera) y proteína ribosomal L32 (RPL32; D. melanogaster) para excluir la saturación y permitir el ajuste entre muestras. Los oligonucleótidos empleados (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania) con sus secuencias se enumeran en los Datos complementarios 1. Los escaneos de geles de agarosa sin recortar y sin procesar se proporcionan en el archivo de datos de origen.

La estructura del exón de glu (LOC552468) en A. mellifera se determinó utilizando datos de RNAseq27 y las secuencias de amplicón obtenidas mediante RT-PCR utilizando ARN derivado de embriones de abejas macho y hembra de 25 a 40 h de edad y tejidos cerebrales de pupas hembras. Las búsquedas de dominio se realizaron con PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57, InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58 y la base de datos Pfam (https://pfam. xfam.org)59. Las proteínas homólogas se identificaron mediante búsquedas BLASTP de la base de datos NCBI con una similitud significativa (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los genes identificados fueron LOC100678462 (Nv-glu; N. vitripennis), LOC106661925 (C. lectularius), LOC103312333 (T. castaneum) y CG12316 (D. melanogaster). Las posiciones homólogas y los posibles límites de los exones codificantes se dedujeron empleando las secuencias de proteínas. Los estados ancestrales se infirieron utilizando el método de máxima parsimonia60. Los análisis de secuencias evolutivas se realizaron utilizando MEGA661. Las secuencias presentadas en la Fig. 7c son las siguientes: A. mellifera XP_026299695.1; Bombus terrestris XP_012165493.2; Eufriesea mexicana OAD55885.1; Megachile rotonda XP_012146010.1; Equinador Acromyrmex XP_011060010.1; Polistes canadensis XP_014601325.1; N. vitripennis XP_003425013.1; Fopius arisanus XP_011314024.1; Orussus abientinus XP_012279333.1; Cephus cinctus XP_015598325.1; Neodiprion lecontei XP_015517082.1.

Los sitios objetivo para los sgRNA se identificaron con el software Benchling (https://benchling.com/). Los sitios objetivo tenían una longitud de 20 nt, comenzaban con una guanidina en 5' y mostraban al menos tres desajustes con objetivos alternativos en el genoma, los posibles objetivos fuera de lugar. Fragmentos de ADN generados por PCR que contienen un sitio de inicio de transcripción de ARN polimerasa T7, la secuencia objetivo y la secuencia de unión a la proteína Cas9. Los sgRNA (secuencias enumeradas en Datos complementarios 1) se sintetizaron utilizando el fragmento de ADN como plantilla y un kit RiboMax (Promega, Walldorf, Alemania). Los sgRNA se purificaron utilizando un kit MEGAclear (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania) y se mezclaron en una proporción molar de 2:1 con 500 ng/µl de proteína Cas9 (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania). Para la mutación dirigida, se agregaron 15–20 pg de dsDNA por 400 µl de mezcla de inyección. Los dsDNA se produjeron de acuerdo con la secuencia proporcionada (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania) con secuencias homólogas flanqueantes de 250 pb. Las secuencias se amplificaron mediante PCR y se purificaron con el kit EZNA Cycle Pure (Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA) antes de la inyección. Se inyectaron embriones de abejas (de 0 a 1,5 h de edad) con 400 µl de una mezcla de sgRNA/Cas9 y se mantuvieron en la incubadora hasta que eclosionaron las larvas55,62. La crianza de larvas se realizó con 170 mg de dieta de obrera (p/v en agua estéril: 50% jalea real, 15% glucosa, 15% lactosa, 1% extracto de levadura)63 a 34 °C bajo 94% de humedad hasta la etapa larvaria. estadio 5. Las larvas se transfirieron a cajas Petri equipadas con papel filtro y se mantuvieron hasta el estadio pupal 4 a 34 °C y 75% de humedad64. Para el análisis de machos glu ex7-8 F, las larvas hembra inyectadas se criaron hasta reinas, y se indujo la puesta de huevos macho mediante el tratamiento con CO2 de reinas vírgenes55. Las crías macho se recolectaron después de eclosionar y se mantuvieron en pequeñas colmenas en una incubadora con abejas obreras jóvenes. El fenotipado se realizó en machos adultos de 1 a 16 días después de la eclosión. Los individuos inyectados fueron seleccionados para las mutaciones deseadas. Se amplificó el sitio objetivo de las mutaciones (ADN para glu y ADNc para el gen fem; Datos complementarios 1)21. En el primer paso, los individuos fueron preseleccionados utilizando diferencias de longitud en los amplicones. Los individuos con deleciones glu ∆ex2-8/∆ex2-8 y mutaciones glu ex7-8 F se identificaron mediante la resolución de amplicones mediante electroforesis en gel. Para otras mutaciones, se realizaron análisis de longitud de fragmentos mediante electroforesis en gel capilar utilizando cebadores marcados con hexaclorofluoresceína para PCR21. Las mutaciones en glu ex7-8 F se verificaron adicionalmente mediante secuenciación de nucleótidos. Identificamos mutaciones de glu tmC2H2 mediante la digestión de restricción de amplicones con la enzima PdiI (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania) y electroforesis en gel. Las variantes de longitud detectadas se validaron adicionalmente en función de las secuencias de nucleótidos obtenidas a través del DNAseq de los amplicones. La PCR de índice se ejecutó con el kit de índice Nextera XT (Illumina, San Diego, EE. UU.) y los amplicones se purificaron con perlas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, EE. UU.). El Center for Biological and Medical Research (BMFZ, Heinrich-Heine University, Alemania) realizó la preparación de bibliotecas y la secuenciación (2 lecturas de 250 pb) con el kit de reactivos MiSeq v2 (500 ciclos; Illumina, San Diego, EE. UU.) después de Illumina protocolos Se generó un mínimo de 78 000 lecturas por muestra en un sistema Illumina MiSeq (Illumina, San Siego, EE. UU.). Las secuencias sin procesar se procesaron y analizaron utilizando el conjunto de herramientas en línea Galaxy (http://usegalaxy.com)65. Se excluyeron las secuencias de baja abundancia que no estaban relacionadas (<5 % de las lecturas)21.

Se utilizó un kit MEGAscript RNAi (Thermo Fisher Scientific, Braunschweig, Alemania) para producir dsRNA (traF, Nv-glu, gfp: secuencia derivada de proteína fluorescente verde). Nv-glu dsRNA se dirigió a la parte común de la transcripción, que está presente en ambos sexos. La secuencia de gfp se amplificó a partir del vector pOPINEneo-3C-GFP, que fue un obsequio de Ray Owens (Addgene plásmido n.º 53534; http://n2t.net/addgene:53534; RRID: Addgene_53534). Se inyectó dsRNA Nv-traF en larvas hembra de cuarto estadio, mientras que dsRNA Nv-glu se inyectó en larvas macho y hembra de segundo estadio, ambos a una concentración de 4000 ng/μl. Se añadió colorante alimentario a la solución de dsRNA (1:9 v/v) para guiar la inyección. La inyección en larvas de N. vitripennis66 se realizó con el inyector FemtoJet® 4i (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Las larvas de segundo estadio inyectadas se transfirieron a sus hospedantes adoptivos (6-8 larvas por hospedador), que se colocaron en placas de PBS 1X66. Las muestras tratadas con dsRNA Nv-traF se recolectaron 3, 4 y 5 días después de la inyección y se agruparon (n = 4 a 5). Las muestras de dsRNA Nv-glu se recolectaron en la etapa adulta para el fenotipado.

La qRT-PCR se realizó con 3 a 7 repeticiones en un sistema en tiempo real CFX96TM (Bio–Rad, Hercules, EE. UU.) siguiendo el procedimiento del kit SensiFASTTM SYBR® No-ROX (Bioline, Londres, Inglaterra). Los cebadores Nv-glu qPCR se diseñaron fuera de la región objetivo del dsRNA. Los valores se analizaron utilizando el software CFX Manager 3.1 (Bio-Rad, Hercules, EE. UU.).

Los niveles de expresión relativos se calcularon utilizando el software LinRegPCR (LinRegPCR, 2017.1.0.0, HFRC, Ámsterdam, Países Bajos)67. La eliminación de Nv-glu se realizó en dos experimentos separados (Fig. 8 complementaria).

Se disecaron cabezas de pupas de abejas y se fotografiaron con un microscopio binocular S8 APO (Leica, Wetzlar, Alemania) con una cámara UI-1240LE-C-HQ (IDS, Obersulm, Alemania) y uEye Cockpit (parte de la suite IDS v4.92, IDS, Obersulm, Alemania) software. Las imágenes para medir el diámetro de la faceta dorsal de la lente se tomaron con una cámara Canon Eos 6d Mark II y un objetivo Canon MP-E65 mm 1:2,8 1–5× Marco (Tokio, Japón). Se obtuvieron imágenes de cabezas adultas de N. vitripennis utilizando un microscopio digital Dino-Lite Edge 5MP y el software DinoCapture 2.0 (Dino-Lite, Almere, Países Bajos). Los parámetros de la cabeza (ancho de la cabeza, largo de la cabeza, ancho de los ojos, largo de los ojos y distancia interocular) se midieron como se presenta esquemáticamente (Fig. 11 complementaria). En machos y controles glu ex7-8 F, el diámetro de la faceta del cristalino se midió en la región frontal-dorsal del ojo, donde las facetas en los machos deberían ser más grandes24. Para el análisis se utilizó la media de 15 diámetros de facetas de lentes medidos al azar por individuo. Las medidas de longitud se realizaron utilizando ImageJ (Instituto Nacional de Salud Mental, EE. UU.).

Los análisis estadísticos de datos se realizaron utilizando SigmaPlot 14.0 (Systat, San José, Estados Unidos de América). La comparación de datos de fenotipo se analizó mediante pruebas U de Mann-Whitney de dos colas (o de una cola en la Fig. 6c). Para las comparaciones de niveles de expresión en N. vitripennis, se aplicaron las pruebas t de Student. Los gráficos de los datos muestran las medias y las desviaciones estándar (Figs. 5c, f, 6c, 7d y Figs. 1, 9, 10 complementarias) o errores estándar (Fig. 8 complementaria). No se excluyeron datos, excepto los datos de fenotipo de eliminación de N. vitripennis, en los que el procedimiento de inyección solo produjo valores atípicos extremos y variaciones para los fenotipos de tamaño de la cabeza (Figura 9 complementaria). Usamos 1,5 veces la desviación estándar como criterio para eliminar dichos valores atípicos68 de los datos de ancho o largo de la cabeza tanto del grupo de control como del grupo tratado después del procedimiento (Fig. 7d y Fig. 9 complementaria). No se realizaron cálculos del tamaño de la muestra. En cambio, el tamaño de la muestra se eligió en base a estudios similares publicados previamente sobre el desarrollo de las abejas. El fenotipo de cada insecto individual derivado de eventos mutacionales o derribados independientes. Estos puntos de datos representan réplicas biológicas independientes. Los investigadores estaban cegados; no sabían si el insecto pertenecía al grupo de tratamiento/mutación o control durante el fenotipado.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores afirman que todos los datos necesarios para confirmar las conclusiones del artículo se presentan dentro del artículo, en las figuras, información y datos complementarios o en el archivo de datos fuente. Los datos de RNA-seq publicados anteriormente analizados aquí están disponibles en NIH GEO con el número de acceso GSE159387. Las secuencias cds específicas del sexo del gen glu se depositaron en la base de datos NCBI con los códigos de acceso OQ116780 y OQ116781 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene). Las bases de datos PROSITE (https://prosite.expasy.org/)57, InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)58, Pfam (https://pfam.xfam.org)59 y La herramienta BLASTP de la base de datos NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) utilizada en este estudio está disponible en línea. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a Eva-Maria Theilenberg, Marion Müller-Borg, Maryam Masrouri y Ann-Christin Langen por su ayuda con el manejo de abejas y el análisis. Agradecemos a Michael Griese por proporcionar colonias de abejas. Agradecemos a Steffen Köhler por tomar fotografías macro de los ojos compuestos. Las moscas de la fruta Drosophila melanogaster fueron un regalo de Hermann Aberle (Universidad Heinrich-Heine de Düsseldorf, Alemania), y los escarabajos Tribolium castaneum fueron un regalo de Gregor Bucher (Universidad de Göttingen, Alemania). Damos las gracias a Daniel Bopp por sus útiles comentarios sobre una primera versión del manuscrito. La secuenciación de amplicones y el control de calidad de la secuenciación fueron realizados por el Centro de Investigación Médica y Biológica (BMFZ) de la Universidad de Düsseldorf (Alemania). El proyecto de abejas fue financiado por Deutsche Forschungsgemeinschaft (números de concesión BE 2194/13-3, BE 2194/10-3; http://www.dfg.de/).

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Genética Evolutiva, Universidad Heinrich-Heine, Düsseldorf, Alemania

Oksana Netschitailo, Anna Wagner, Vivien Sommer y Martin Beye

Laboratorio de Entomología, Universidad de Wageningen, Wageningen, Países Bajos

Yidong Wang y Eveline C. Verhulst

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Correspondencia a Oksana Netschitailo o Martin Beye.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Michael Perry, Giuseppe Saccone y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Netschitailo, O., Wang, Y., Wagner, A. et al. La función y evolución de un interruptor genético que controla la diferenciación del ojo sexualmente dimórfico en las abejas. Nat Comun 14, 463 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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Recibido: 29 enero 2022

Aceptado: 18 de enero de 2023

Publicado: 28 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36153-4

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