Potencial anti in vitro - Atrapasueños de Sichuan inc.

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21165 (2022) Citar este artículo

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Las infecciones bacterianas y virales son un grave problema de salud pública. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar el potencial antibacteriano, antibiopelícula y antiviral del extracto hidroalcohólico crudo de Propóleo Rojo Brasileño (BRP), fracciones y compuestos aislados, así como su toxicidad in vivo. La actividad antibacteriana se evaluó mediante la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y la actividad antibiopelícula mediante la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria de Biopelícula (MICB50). También se obtuvo el conteo de bacterias viables (Log10 UFC/mL). Los ensayos antivirales se realizaron infectando células BHK-21 con Chikungunya (CHIKV) nanoluc. La toxicidad del BRP se evaluó en el modelo animal de Caenorhabditis elegans. Los valores de MIC para la muestra de extracto hidroalcohólico crudo oscilaron entre 3,12 y 100 μg/mL, mientras que para las fracciones y compuestos aislados los valores de MIC oscilaron entre 1,56 y 400 μg/mL. El extracto hidroalcohólico crudo de BRP, la oblongifolina B y la gutiferona E presentaron valores de MICB50 oscilando entre 1,56 y 100 μg/mL contra biopelículas monoespecies y multiespecies. Neovestitol y vestitol inhibieron la infección por CHIKV en un 93,5 y un 96,7 %, respectivamente. Las pruebas para evaluar la toxicidad en C. elegans demostraron que el BRP no era tóxico por debajo de las concentraciones de 750 μg/mL. Los resultados constituyen un enfoque alternativo para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas.

A pesar de los importantes avances en el área de la salud, las enfermedades infecciosas han constituido un grave problema de salud pública a lo largo del tiempo1. Un ejemplo es la periodontitis, una enfermedad inflamatoria que afecta al aparato de soporte dentario y que es causada por microorganismos presentes en las biopelículas de las placas de disbiosis2. Según Mehrotra y Singh3, alrededor del 2,6 % de los afroamericanos, el 5 % de los africanos, el 0,2 % de los asiáticos, el 1 % de los norteamericanos y el 0,3 % de los sudamericanos han sido diagnosticados con periodontitis en su forma más grave. El tratamiento periodontal es fundamental no solo para los parámetros dentales, sino también para evitar otras condiciones patológicas como reacciones adversas en el embarazo, enfermedades cardiovasculares y respiratorias, cáncer, lupus, artritis reumatoide, diabetes mellitus y enfermedad renal crónica4. Si bien la enfermedad puede ser tratada con antibióticos, la infección puede agravarse en pacientes sin tratamiento o en presencia de bacterias periodontopatógenas resistentes5.

Las enfermedades virales también son una carga para el sistema de salud mundial debido a la falta de vacunas y antivirales aprobados para combatir importantes virus humanos, incluida la fiebre chikungunya, causada por el virus chikungunya (CHIKV)6. El CHIKV se identificó en 2014 y se ha vuelto hiperendémico en Brasil7. Este virus causa síntomas similares al dengue, como fiebre, fatiga, artralgia y poliartralgia8. Hasta abril de 2022, se habían registrado 28.291 casos sospechosos de fiebre chikungunya y se habían confirmado cinco muertes en Brasil; otras ocho muertes están bajo investigación9.

Según la Organización Mundial de la Salud, una parte considerable de la población mundial aún depende de la medicina tradicional y emplea productos naturales para tratar diversas enfermedades10. Los países en desarrollo utilizan principalmente estos productos. En este escenario, Brasil es una valiosa fuente de productos naturales dado que posee fauna y flora diversa11. El propóleo rojo brasileño (BRP), un material resinoso producido por las abejas Apis mellifera a través de la recolección de los exudados de dos especies de plantas: Dalbergia ecastaphyllum12,13 y Symphonia globulifera14 tiene un excelente potencial para el desarrollo de nuevos medicamentos. BRP es actualmente uno de los tipos de propóleos brasileños más producidos y comercializados. Se encuentra principalmente en los manglares brasileños del Nordeste, especialmente en los estados de Alagoas y Bahía15.

BRP se compone de 50 % de resina, 30 % de cera, 10 % de aceites esenciales, 5 % de polen y 5 % de otros compuestos, incluidos metabolitos secundarios como flavonoides, isoflavonoides, derivados del ácido cinámico, ésteres, benzofenonas polipreniladas y algunos terpenos, que son considerados los principales constituyentes biológicamente activos de este tipo de propóleos16. Las moléculas aisladas de BRP no se encuentran en ningún otro tipo de propóleos, lo que los convierte en productos naturales raros y únicos17. Se han observado variaciones de esta composición entre localidades. Algunos estudios revelaron que compuestos como la formononetina y la isoliquiritigenina son los más abundantes en muestras de Alagoas18. En cambio, en la muestra "Canavieiras", se identificaron como principales compuestos vestitol, neovestitol, medicarpina y benzofenonas polipreniladas17. En este sentido, se ha informado que BRP posee actividades antibacterianas15,18,19,20, antiparasitarias21,22,23,24,25,26,27 y antivirales28.

Teniendo en cuenta la falta de opciones de tratamiento para la periodontitis y la infección por CHIKV, hemos planteado la hipótesis de que BRP y sus compuestos aislados son un candidato prometedor para el tratamiento de estas enfermedades. Según nuestro conocimiento, no hay datos sobre la acción antiviral de BRP contra CHIKV, y pocos estudios han informado sobre su acción antibacteriana contra bacterias periodontopatógenas13,18,28,29,30. El uso de BRP como opción terapéutica podría reducir el uso de antibióticos en casos de periodontitis y convertirse en una estrategia antiviral novedosa contra CHIKV28.

Este estudio tuvo como objetivo evaluar el potencial antibacteriano, antibiopelícula y antiviral in vitro del extracto hidroalcohólico crudo, las fracciones y los compuestos aislados de BRP, así como su toxicidad en un modelo in vivo.

El análisis cromatográfico reveló la presencia de isoflavanas (vestitol, neovestitol, 7-O-metilvestitol), pterocaparnas (medicarpina) y acilfloroglucinoles poliprenilados (mezcla de gutiferona E/xantoquimol y oblongifolina B) (fig. 1), como compuestos principales del BRP. El perfil cromatográfico de las fracciones reveló la presencia prominente de acilfloroglucinoles poliprenilados en la fracción de hexano, mientras que las fracciones de diclorometano, acetato de etilo y n-butanol estaban compuestas principalmente de isoflavanas (consulte la Figura complementaria S1).

Perfil cromatográfico del extracto de propóleo rojo brasileño y estructuras químicas de sus principales compuestos. Los números corresponden a: vestitol (1); neovestitol (2); medicarpina (3); 7-O-metilvestitol (4); gutferona E/xantoquimol 59; y oblongifolina B (6).

En las tablas 1 y 2 se muestran los resultados de la CIM del extracto hidroalcohólico crudo, fracciones y compuestos aislados frente a bacterias periodontales incluidas en el estudio. Los valores de MIC para la muestra de extracto hidroalcohólico crudo oscilaron entre 3,12 y 100 μg/mL, para la fracción de diclorometano de 1,56 a 200 μg/mL, acetato de etilo de 12,5 a 400 μg/mL, hexano de 3,12 a 400 μg/mL y n-Butanol de 100 a 400 μg/mL (Cuadro 1).

Para el metilvestitol, los valores de MIC variaron de 25 a 400 μg/mL, medicarpina de 50 a 400 μg/mL, vestitol de 12,5 a 200 μg/mL, neovestitol de 12,5 a 100 μg/mL, oblongifolina B de 3,12 a 50 μg /mL, y gutferona E de 1.56 a 200 μg/mL (Tabla 2).

El extracto hidroalcohólico crudo de BRP redujo la formación de biopelículas monoespecies de las cepas estándar (ATCC) y sus aislados clínicos (Fig. 2). Además, disminuyó el número de células viables en la biopelícula monoespecífica expresada como Log10 CFU/mL (Fig. 2). El valor más bajo de MICB50 obtenido para el extracto hidroalcohólico crudo de BRP frente a los biofilms monoespecies fue de 3,12 μg/mL frente a A. naeslundii (ATCC 19039) y F. nucleatum (aislado clínico) (fig. 2e y f). Frente a los demás biofilms monoespecies evaluados, el extracto hidroalcohólico crudo BRP presentó MICB50 de 6,25 μg/mL, excepto P. intermedia (aislado clínico), frente al cual MICB50 fue de 12,5 μg/mL. Sin embargo, incluso a concentraciones superiores a MICB50, detectamos células de biopelícula viables (Fig. 2a-f).

Actividad antibiopelícula de muestras de extracto hidroalcohólico crudo de propóleo rojo brasileño y número de células viables en biopelículas monoespecies formadas por cepas ATCC y aislados clínicos incluidos en el estudio. (a) P. gingivalis (ATCC 49417). (b) P. gingivalis (aislado clínico). (c) P. intermedia (ATCC 15033). (d) P. intermedia (aislado clínico). (e) A. naeslundii (ATCC 19039). (f) F. nucleatum (aislado clínico).

En cuanto a los compuestos aislados probados, también redujeron la formación de biopelículas monoespecies. En presencia de oblongifolina B (Fig. 3), el MICB50 más bajo fue de 0,78 μg/mL frente a A. naeslundii (ATCC 19039) (Fig. 3c). Frente a los demás biofilms monoespecies evaluados, los valores de MICB50 oscilaron entre 1,56 y 6,25 μg/mL. La oblongifolina B a 6,25 μg/mL eliminó las células viables de P. gingivalis (aislado clínico) y, a 12,5 μg/mL, eliminó las células viables de P. intermedia (ATCC 15033) y F. nucleatum (aislado clínico) (Fig. 3a,b yd).

Actividad antibiopelícula de oblongifolina B y número de células viables en biopelículas monoespecies formadas por cepas ATCC y aislados clínicos incluidos en el estudio. (a) P. intermedia (aislado clínico) (b) P. intermedia (ATCC 15033). (c) A. naeslundii (ATCC 19039). (d) F. nucleatum (aislado clínico).

La gutferona E presentó MICB50 bajo (0.78 μg/mL) contra A. naeslundii (ATCC 19,039) (Fig. 4d). Contra las otras biopelículas de monoespecies evaluadas, MICB50 varió de 1.56 a 25 μg/mL (Fig. 4a, b, c y e). La gutferona E eliminó todas las células del biofilm a partir de una concentración de 3,12 μg/mL contra P. gingivalis (aislado clínico), 6,25 μg/mL contra P. intermedia (ATCC 15033), 25 μg/mL contra F. nucleatum (aislado clínico), y 1,56 μg/mL contra A. naeslundii (ATCC 19039). En cuanto a P. gingivalis (ATCC 49417), verificamos la presencia de células de biopelícula viables incluso en concentraciones superiores a MICB50 (Fig. 4a).

Actividad antibiopelícula de gutferona E y número de células viables en biopelículas monoespecies formadas por cepas ATCC y aislados clínicos incluidos en el estudio. (a) P. gingivalis (ATCC 49417). (b) P. gingivalis (aislado clínico). (c) P. intermedia (ATCC 15033). (d) A. naeslundii (ATCC 19039). (e) F. nucleatum (aislado clínico).

También evaluamos la actividad del extracto hidroalcohólico crudo de BRP y los compuestos aislados frente al biofilm multiespecífico formado por cepas estándar (grupo 1) y aislados clínicos (grupo 2) (fig. 5). El extracto hidroalcohólico crudo de BRP tenía un MICB50 de 6,25 μg/mL frente al biofilm multiespecies del grupo 1. Sin embargo, incluso a concentraciones más altas, todavía se encontraron células viables en el biofilm. Se encontraron resultados similares contra el biofilm multiespecies del grupo 2: MICB50 fue de 6,25 μg/mL, y también había células de biofilm viables por encima de la concentración de MICB50 (Fig. 5A).

Actividad antibiopelícula de muestras de extracto hidroalcohólico crudo de propóleo rojo brasileño, oblongifolina B y gutferona E y número de células viables en biopelículas multiespecies formadas por bacterias de los grupos 1 (cepas estándar) y 2 (aislados clínicos). (A) Extracto crudo. (B) Oblongifolina B. (C) Guttiferona E.

Con respecto a la oblongifolina B, tuvo el MICB50 más bajo contra el biofilm multiespecie del grupo 1 (1.56 μg/mL); sin embargo, a concentraciones superiores a MICB50, las células permanecieron viables en la biopelícula. Frente al biofilm multiespecies del grupo 2, la oblongifolina B presentó MICB50 de 50 μg/mL y eliminó todas las células del biofilm del biofilm a esta misma concentración (Fig. 5B). Por otro lado, la gutferona E mostró MICB50 de 3.12 μg/mL contra el biofilm multiespecie del grupo 1, y 6.25 μg/mL de gutferona E eliminó todas las células del biofilm. Contra el biofilm multiespecies del grupo 2, la gutferona E tenía un MICB50 más alto (100 μg/mL), pero 50 μg/mL de gutferona E también eliminaban todas las células viables del biofilm (Figs. 5C).

En cuanto al control (metronidazol), el MICB50 de las biopelículas monoespecies osciló entre 2,95 y 5,9 μg/mL. En cuanto a las biopelículas mixtas, el MICB50 fue de 2,95 μg/mL tanto para la biopelícula formada por el grupo 1 como para la biopelícula formada por el grupo 2 (véanse las Figuras S2 y S3 del material complementario).

Para evaluar más a fondo los efectos del extracto de BRP y sus compuestos aislados, se trataron células BHK 21 con cada extracto a 50, 10 y 2 μg/mL y se midió la viabilidad celular 16 h después. Los resultados demostraron que las células toleraron n-butanol a 50 μg/mL (98,4 %), acetato de etilo a 10 μg/mL (95,9 %), mientras que el extracto crudo, diclorometano y hexano a 2 μg/mL (99,3, 99,8, y 100%, respectivamente), (Cuadro 3). Mediante el empleo de células BHK-21 infectadas con CHIKV-nanoluc, se evaluaron las actividades anti-CHIKV de cada muestra, a las concentraciones máximas no citotóxicas seleccionadas a través del ensayo de viabilidad. Los resultados demostraron que el n-butanol inhibió significativamente el 69% de la replicación de CHIKV (Fig. 6). Las demás muestras no presentaron efecto sobre la infección por CHIKV (Fig. 6).

Viabilidad celular y tasas de replicación de CHIKV en presencia de extracto hidroalcohólico crudo y fracciones de propóleo rojo brasileño.

Para las sustancias aisladas (medicarpina, neovestitol, vestitol, oblongifolina B, metilvestitol y gutferona E), las células BHK-21 se trataron con concentraciones de cada compuesto que oscilaban entre 32 y 0,5 μg/mL. Como resultado, el tratamiento con compuestos en concentraciones superiores a 3 µg/mL presentó tasas de viabilidad celular superiores al 80 % (Tabla 4), y se seleccionó la concentración no citotóxica más alta de cada compuesto para el ensayo antiviral. Dado que medicarpin, neovestitol y vestitol a 14 µg/mL presentaron citotoxicidad (Tabla 4) y a 3 µg/mL no mostraron actividad antiviral (Figura complementaria S4), se seleccionó la concentración alternativa de 11 µg/mL para los ensayos posteriores. Por lo tanto, la actividad antiviral de medicarpina, neovestitol y vestitol se probó a 11 µg/mL, gutferona E y oblongifilina B a 6 µg/mL y metilvestitol a 14 µg/mL. Los compuestos medicarpina, neovestitol y vestitol inhibieron la replicación de CHIKV in vitro en un 86%, 94% y 97% respectivamente (Fig. 7).

Efectos de los compuestos aislados en la infección por CHIKV y la viabilidad celular.

Para evaluar la toxicidad del extracto hidroalcohólico crudo de BRP y compuestos aislados en un sistema in vivo, se empleó la técnica de determinación de la concentración más baja capaz de matar el 50% (LC50) de las larvas en relación al tiempo de incubación. La Figura 8 muestra la evaluación de la toxicidad del extracto hidroalcohólico crudo de BRP, oblongifolina B y gutferona E en función del tiempo y la concentración. La CL50 del extracto hidroalcohólico crudo de BRP y oblongifolina B fue de 1500 μg/mL, determinada el segundo día de incubación (Fig. 8A y B). Por otro lado, la gutferona E tuvo una CL50 de 750 μg/mL, determinada el último día de incubación (Fig. 8C).

Evaluación de la toxicidad del extracto hidroalcohólico crudo de Propóleo Rojo Brasileño y los compuestos aislados gutferona E y oblongifolina B en el modelo in vivo de C. elegans. (A) Extracto hidroalcohólico bruto. (B) Oblongifolina B. (C) Guttiferona E.

Durante años, el propóleo se ha utilizado para tratar infecciones en la medicina popular y su potencial antimicrobiano ha sido demostrado por la comunidad científica15. Este potencial biológico puede estar relacionado con su composición química diferenciada.

Sesquiterpenos, pterocarpanos e isoflavanos caracterizan al propóleo rojo brasileño. La composición química del propóleo rojo es muy diferente a la de otros tipos de propóleo, como el propóleo marrón, que se caracteriza por tener hidrocarburos, aldehídos y monoterpenos; y el propóleo verde, que se caracteriza por los hidrocarburos aromáticos policíclicos, los sesquiterpenos y los derivados de la naftalina31.

Vestitol, neovestitol y medicarpina han sido reportados como compuestos principales en el propóleo rojo de Canavieiras, estado de Bahía, Brasil. Por otro lado, formononetina, calicosina, biocanina A e isoliquiritigenina se detectaron en concentraciones más bajas17. La gutferona E y la oblongifolina B se describieron como marcadores químicos del propóleo rojo14, pero parecen estar en concentraciones más bajas en la muestra estudiada en comparación con los isoflavanos. Los triterpenos β-amirina y glutinol también han sido descritos en BRP de esta localidad14.

Según Rios y Recio32 y Gibbons33, los valores de CIM por debajo de 100 µg/mL para extracto hidroalcohólico crudo o por debajo de 10 µg/mL para compuestos aislados se consideran prometedores al evaluar la actividad antibacteriana de extractos de plantas, aceites esenciales y compuestos aislados de fuentes naturales. Sobre la base de estos criterios y considerando los valores MIC presentados aquí para todas las muestras de BRP evaluadas, el extracto hidroalcohólico crudo de BRP y los compuestos aislados gutferona E y oblongifolina B mostraron la mejor actividad de inhibición contra la mayoría de las bacterias evaluadas.

La fracción de diclorometano de propóleo rojo no se ensayó ya que la selección se basó en el efecto de los constituyentes individuales de cada fracción. Los compuestos principales de la fracción de hexano, oblongifolina B y gutferona E, mostraron una buena actividad en las pruebas individuales, en comparación con los compuestos individuales de la fracción de diclorometano.

Estas muestras mostraron actividad antibacteriana principalmente contra P. gingivalis (ATCC 49417), considerada la especie clínicamente más importante en el desarrollo de la enfermedad periodontal34 y la bacteria F. nucleatum (aislado clínico), también considerada un patógeno relevante ya que empeora la inflamación gingival y la pérdida de dientes35 . Estos resultados demostraron la relevancia de estos productos naturales en el control y tratamiento de la enfermedad periodontal. En este trabajo, el extracto hidroalcohólico crudo de BRP, las fracciones (n-hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol) y los compuestos aislados (metilvestitol, medicarpina, vestitol, neovestitol, oblongifolina B y gutferona E) fueron analizados para su actividad antibacteriana contra aislados clínicos y las cepas ATCC. Las cepas de ATCC son más estables desde un punto de vista genético y, por lo tanto, representarían la especie de bacteria, lo que permitiría la comparación con otras investigaciones. El ensayo in vitro brinda una indicación confiable de cómo responde el microorganismo al agente objetivo, y debe aceptarse la extrapolación de los resultados para esa especie o incluso género. Los aislados clínicos (también conocidos como cepas silvestres) son bacterias cuyo metabolismo puede verse alterado por las condiciones ambientales y su genética modificada por la circulación en la población, lo que justificaría la pertinencia de evaluar estos dos tipos de cepas.

Los valores de MIC (1,56–400 µg/mL) para las otras bacterias evaluadas fueron significativamente más bajos en comparación con los datos de la literatura. Bueno-Silva et al.29 evaluaron la actividad antibacteriana del extracto crudo y compuestos aislados neovestitol y vestitol obtenidos de BRP del mismo origen botánico contra A. naeslundii (ATCC 12104), y reportaron valores de CIM de 25, 25 y 50 µg/mL, respectivamente. Aquí, neovestitol y vestitol no fueron prometedores contra varias de las bacterias periodontales evaluadas. Otro punto a destacar es que el valor de MIC para el extracto crudo reportado por Bueno-Silva et al.29 contra A. naeslundii (ATCC 12104) se asemeja al valor obtenido por nosotros contra A. naseslundii (ATCC 19039), lo que sugiere una relación de susceptibilidad de especies para el extracto crudo.

Santos et al.36 evaluaron la actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico acuoso y fracciones (hexano, diclorometano y acetato de etilo) obtenidos de otro tipo de propóleos, de la región de "Cachoeira da Prata", Minas Gerais—Brasil, que es también recolectado de abejas Apis mellifera. Las bacterias analizadas fueron F. nucleatum periodontal (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 33277) y P. intermedia (ATCC 25611). El extracto dio valores de MIC de 1024, 256 y 256 µg/mL contra F. nucleatum (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 33277) y P. intermedia (ATCC 25611), respectivamente. En cuanto a las fracciones, los valores de MIC oscilaron entre 512 y > 1024 µg/mL. Los resultados de MIC contra estas bacterias fueron más altos que los presentados aquí para el extracto hidroalcohólico crudo y las fracciones de BRP contra la misma especie bacteriana pero de diferentes cepas: encontramos valores de MIC de 100, 3.12 y 6.25 µg/mL para el extracto crudo contra F nucleatum (ATCC 10953), P. gingivalis (ATCC 49417) y P. intermedia (ATCC 15033), respectivamente. En cuanto a las fracciones, encontramos valores de CIM que oscilan entre 12 y 400 µg/mL frente a la misma bacteria. Por lo tanto, en comparación con los resultados descritos por estos autores, el extracto hidroalcohólico crudo de BRP y las fracciones empleadas aquí fueron más efectivos contra las bacterias periodontales.

Además, estos autores compararon los resultados de MIC que obtuvieron con el extracto crudo y las fracciones mediante análisis ANOVA. No encontraron diferencias en la actividad antibacteriana de las fracciones o extracto frente a las bacterias evaluadas. Esto corrobora nuestros resultados: el extracto hidroalcohólico crudo BRP fue más promisorio que las fracciones y dio mejores valores contra todas las bacterias evaluadas, mientras que las fracciones presentaron actividad antibacteriana contra solo dos bacterias (P. gingivalis ATCC 49417 y aislado clínico).

Shabbir et al.37 evaluaron la actividad del extracto crudo de propóleo recolectado en Skardu (Pakistán) procedente de Robinia pseudoacacia, Elegnus agustifolia (olivo ruso) y Acacia modesta, recolectados de abejas Apis mellifera. Los productos naturales proporcionaron valores de CIM que oscilaron entre 64 y 512 µg/mL frente a aislados clínicos de P. gingivalis y P. intermedia. Nuestros resultados sugirieron que BRP es más efectivo que el propóleo utilizado por Shabbir et al.37 ya que los valores de MIC que obtuvimos para el extracto hidroalcohólico crudo de BRP contra los aislados clínicos de P. gingivalis y P. intermedia fueron más bajos (12.5 y 6.25 µg/mL, respectivamente). Por lo tanto, BRP demostró tener una actividad más prometedora que el propóleo de otros países dado que está compuesto por compuestos únicos que normalmente no se encuentran en otros tipos de propóleo15.

La inhibición de la formación de biopelículas por parte de estas bacterias puede contribuir a reducir la periodontitis. De hecho, Al-Ahmad et al.38 describieron que A. naeslundii y F. nucleatum desempeñan los roles de bacteria colonizadora inicial y colonizadora tardía, respectivamente. Se demostró que esta última bacteria está presente en tasas superiores al 50 % después de 62 h de formación de biopelícula, lo que contribuye al aumento de la inflamación y la pérdida de dientes38.

Otros estudios han evaluado la actividad antibiofilm monoespecies de BRP frente a otros tipos de bacterias. de Souza Silva et al.39 evaluaron la actividad antibiopelícula del extracto hidroalcohólico crudo de BRP (BRP recolectado en la misma región que el BRP utilizado en nuestro estudio) recubierto en nanopartículas poliméricas contra Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus aureus (ATCC 33591) , Staphylococcus aureus (ATCC 43300) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). El extracto hidroalcohólico crudo libre de BRP y el extracto recubierto de nanopartículas inhibieron la biopelícula formada por las cepas Gram-positivas de manera más efectiva en comparación con la biopelícula formada por las cepas Gram-negativas, con valores de concentración inhibitoria de biopelícula que oscilaron entre 15,6 y 125 μg/mL contra las cepas de S. aureus y de 100 a 1560 μg/mL contra la cepa de P. aeruginosa. Estos resultados corroboraron nuestros hallazgos dado que verificamos los valores más bajos de MICB50 contra la bacteria Gram-positiva A. naeslundii (ATCC 19039) 3.12 μg/mL para el extracto crudo y 0.78 μg/mL para los compuestos aislados oblongifolina B y gutferona E.

Miranda et al.13 evaluaron la actividad antibiopelícula del extracto hidroalcohólico crudo de BRP del mismo origen botánico que el BRP aquí utilizado. Estos autores dividieron las bacterias evaluadas en complejos (Actinomyces, morado, amarillo, verde, naranja, rojo y otros). A concentraciones de extracto de 800 y 1600 μg/mL, los autores mostraron una disminución del 40 y 45 % en la actividad metabólica de las biopelículas multiespecies formadas por estos complejos, respectivamente. de Figueiredo et al.30 también evaluaron la actividad antibiofilm del extracto crudo de BRP a 1600, 800 y 400 μg/mL y obtuvieron una reducción del 56, 56 y 57% en la actividad metabólica del biofilm, respectivamente. Nuestro estudio no evaluó la erradicación, pero evaluó la capacidad de las muestras de BRP para inhibir la formación de biopelículas. Según Wei et al.40, inhibir la formación de biopelículas es mucho más importante que erradicarla porque la inhibición de la formación de biopelículas impide el crecimiento bacteriano y, por tanto, la maduración bacteriana. Los resultados presentados aquí demostraron que las muestras de BRP inhibieron la formación de biopelículas de múltiples especies por bacterias periodontales en al menos un 50 %. La oblongifolina B dio el valor MICB50 más bajo (1,56 μg/mL) frente a la biopelícula multiespecie formada por las cepas ATCC. En cuanto al biofilm multiespecífico formado por los aislados clínicos, el valor más bajo de MICB50 fue de 6,25 μg/mL. Estos resultados sugirieron que los compuestos aislados oblongifolina B y gutferona E inhibían todas las células viables de la mayoría de las biopelículas monoespecies y multiespecies formadas por las bacterias incluidas en este estudio. Esto señaló que las muestras de BRP pueden inhibir la formación de biopelículas y llegar a las células dentro de esta comunidad bacteriana, eliminándolas y dejando solo el conjugado de glicoproteína sin células vivas13.

Vale la pena mencionar que los valores de MICB50 encontrados en este trabajo son relativamente bajos, especialmente para los aislados clínicos que generalmente son más resistentes y demandan concentraciones más altas. Sin embargo, a la concentración más baja capaz de inhibir la formación de biopelículas en al menos un 50 %, la denominada MICB50, demostramos una inhibición de al menos un 50 % de la biopelícula. En otras palabras, esto no correspondía a una inhibición total del biofilm, lo que probablemente requeriría una mayor concentración.

Ya se ha demostrado que los componentes bioactivos del propóleos como flavonoides, ésteres, alcoholes, aceites esenciales y otros compuestos orgánicos muestran actividad antiviral contra virus como el virus del herpes (HSV-1 y HSV-2), el virus sindbis, el virus de la parainfluenza, el citomegalovirus, VIH y Varicela zoster (HSV-1 y HSV-2), virus sindbis, virus parainfluenza, citomegalovirus, VIH y Varicela zoster41,42. Además de las actividades antibacteriana y antibiopelícula de BRP demostradas en este estudio, evaluamos la actividad anti-CHIKV del extracto hidroalcohólico crudo, las fracciones y las sustancias puras de BRP. Evaluamos la viabilidad de las células BHK-21 en presencia de las muestras de BRP mediante el ensayo MTT. En el descubrimiento de fármacos, las muestras se consideran no tóxicas cuando la tasa de viabilidad celular es superior al 50 %, moderadamente citotóxicas cuando la tasa de viabilidad celular varía entre el 25 y el 50 % y altamente citotóxicas cuando la tasa de viabilidad celular es inferior al 25 %43. En este estudio, todas las muestras evaluadas presentaron viabilidad celular igual o superior al 80% a una concentración de 50 μg/mL para el extracto crudo y fracciones y 3 μg/mL para los compuestos aislados (Cuadros 3 y 4). Todas las muestras de BRP evaluadas en este estudio proporcionaron una viabilidad celular BHK-21 igual o superior al 80% (Tablas 3 y 4), que fue superior a la viabilidad celular encontrada por Rufatto et al. 20, (entre 14,5 y 46%).

En cuanto a los ensayos de infección, los compuestos aislados neovestitol y vestitol proporcionaron los resultados más prometedores, con tasas de inhibición de la infección por virus del 94 y 97%, respectivamente (Fig. 7). Aunque se han descrito varios compuestos naturales con actividad antiviral, incluida la actividad anti-CHIKV, no se ha evaluado el potencial antiviral de neovestitol y vestitol. Nuestros resultados mostraron tasas de inhibición superiores a las reportadas en otros estudios con moléculas naturales, como el estudio de Pohjala et al.44, quienes obtuvieron un límite de inhibición de la infección de como máximo el 75% cuando cribaron 356 compuestos, siendo 123 de ellos naturales. . Hasta donde sabemos, no hay informes sobre la actividad anti-CHIKV de BRP o compuestos aislados. Esto demuestra la importancia de capitalizar el potencial de BRP como candidato para el tratamiento antiviral. Nuestro estudio ha sido pionero en la evaluación de la actividad anti-CHIKV de BRP y ha logrado tasas de inhibición expresivas, allanando el camino para el desarrollo de antivirales contra CHIKV y otros virus.

Para que BRP sea aplicable de forma segura, su toxicidad debe evaluarse en diferentes modelos experimentales. El modelo murino es el modelo in vivo más utilizado para evaluar la toxicidad de los tratamientos, pero presenta inconvenientes como el alto costo, el difícil mantenimiento y la demora en la obtención de resultados, entre otros45. Por lo tanto, aquí evaluamos la toxicidad utilizando otro modelo in vivo, el nematodo C. elegans, un animal completo con sistemas digestivo, reproductivo, endocrino y neuromuscular. Además de ser pequeño, tener un ciclo de vida corto y ser fácil de mantener, C. elegans posee entre un 60% y un 80% de homología genética con los humanos46. En este contexto, evaluamos las muestras de BRP más prometedoras por su toxicidad frente a C. elegans. La concentración más baja capaz de matar al menos el 50% de las larvas (CL50) fue de 1500 μg/mL para el extracto hidroalcohólico crudo BRP y oblongifolina B y 750 μg/mL para gutiferón E. Estos valores fueron significativamente superiores a todos los MIC y MICB50 concentraciones reportadas en este estudio.

Además, por debajo de esta concentración, incluso después de haber expuesto las larvas a muestras de BRP durante dos días, no se alcanzó la CL50, lo que demuestra el perfil no tóxico de estos productos naturales. Curiosamente, los valores de CL50 de las muestras de BRP contra C. elegans obtenidos en este estudio fueron más altos que los valores de CL50 de otros tipos de propóleos brasileños evaluados contra C. elegans. Por ejemplo, Campos y colaboradores (2015)47 informaron que las muestras de propóleo poseían una CL50 de 461,8 μg/mL. Aquí, las concentraciones de BRP determinadas como tóxicas fueron altas, por encima del valor más alto de MIC (400 μg/mL). Por lo tanto, el propóleo no es tóxico en las concentraciones utilizadas en este estudio y puede emplearse de manera segura en concentraciones por debajo de 1500 y 750 μg/mL. Los resultados aquí obtenidos son sumamente relevantes, pues a través de diferentes metodologías se demostró la actividad antibacteriana del propóleo rojo brasileño frente a un panel de bacterias periodontopatógenas. Otro punto a destacar es la actividad anti-CHIKV de los compuestos aislados de BRP. La infección por Chikungunya tiene una alta incidencia y severidad, por lo que la búsqueda de nuevas opciones de tratamiento es muy deseable. Nuestros resultados constituyen un paso inicial para futuros estudios de BRP como un enfoque alternativo para el tratamiento de diversas enfermedades infecciosas.

El propóleo rojo brasileño utilizado en este estudio tiene actividad antibacteriana contra un panel de bacterias periodontopatógenas. Además, su extracto crudo y los compuestos aislados de oblongifolina B y gutferona E en concentraciones similares o ligeramente superiores a las concentraciones de MIC inhiben las biopelículas monoespecies y multiespecies en más del 50%. Medicarpin, neovestitol y vestitol inhiben fuertemente la infección por CHIKV in vitro. Además, las pruebas de toxicidad en C. elegans demostraron que el extracto crudo, la oblongifolina B y la gutferona E no son tóxicos, demostrando ser seguros y prometedores para que, en el futuro, estas muestras de propóleo puedan usarse como medicamento.

BRP se recolectó en Canavieiras Estado de Bahía, Brasil, en marzo de 2019 en la Asociación de Apicultores de Canavieiras (COAPER). El BRP se congeló y se extrajo con solución de etanol hidroalcohólico al 70%, como lo describen Santiago et al.48. El extracto hidroalcohólico bruto de BRP se repartió con disolventes orgánicos (hexano, diclorometano, acetato de etilo y n-butanol). Para caracterizar las muestras se utilizaron estándares auténticos de BRP (7-O-metilvestitol, medicarpina, vestitol, neovestitol, oblongifolina B y guttiferona E) previamente aislados por nuestro grupo de investigación17.

El análisis cromatográfico del extracto de BRP y sus fracciones se realizó en un instrumento HPLC Waters 2695, acoplado a un detector de matriz de fotodiodos (PDA) 2998, con el software Empower 3 como controlador. Los perfiles cromatográficos se realizaron en una columna Supelco Ascentis Express C-18 (150 × 4,6 mm, 2,7 µm). La fase móvil con agua (A) (0,1 % de ácido fórmico) y acetonitrilo (B) se utilizó de la siguiente manera: 10 → 100 % de B hasta los 80 min; 100% de B en 89 min; 100 → 10% en 90 min, manteniendo la condición hasta los 95 min. Las inyecciones se realizaron con un caudal de 1 ml/min, a 40 °C y un volumen de inyección de 10 µl. Los cromatogramas se registraron a 275 nm.

Para los ensayos antibacteriano, antiviral y de toxicidad se utilizó el extracto hidroalcohólico crudo de BRP, fracciones en diclorometano, hexano, acetato de etilo, n-butanol, así como los compuestos aislados gutferona E, oblongifolina B, metilvestitol, medicarpina, vestitol y neovestitol.

Las cepas bacterianas periodontopatógenas empleadas en los ensayos de actividad antibacteriana y antibiofilm se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC); sus respectivos aislamientos clínicos se obtuvieron de infecciones periodontales humanas. Las cepas incluían Porphyromonas gingivalis (ATCC 49417 y aislado clínico), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953 y aislado clínico), Prevotella intermedia (ATCC 15033 y aislado clínico) y Actinomyces naeslundii (ATCC 19039 y aislado clínico). Esas bacterias forman parte de la colección del Laboratorio de Ensayos Antimicrobianos (LEA, sigla en portugués) de la Universidad Federal de Uberlândia (UFU) y fueron criopreservadas a −20 °C. Para los ensayos de toxicidad in vivo se utilizó la cepa mutante Caenorhabditis elegans AU37, obtenida del Genetics Center (CGC, University of Minnesota).

Para los ensayos antivirales, se rescató un CHIKV que expresaba el indicador Nanoluciferase (CHIKV-nanoluc) basado en la cepa CHIKV LR2006PYY1 (genotipo de África Oriental/Central/Sudáfrica)49. Los protocolos se llevaron a cabo como se describió previamente50.

La actividad antibacteriana del extracto hidroalcohólico crudo BRP, fracciones y compuestos aislados se evaluó por el método de microdilución en caldo, por triplicado. Los ensayos se realizaron en microplacas de 96 pocillos; Se siguió la metodología recomendada por el Clinical and Laboratory Standards Institute52, con modificaciones. El inóculo se estandarizó a la escala McFarland 0,5 y se diluyó a una concentración bacteriana de 1,5 × 106 CFU/mL en los pocillos. Para preparar las muestras, el extracto hidroalcohólico crudo, las fracciones o los compuestos aislados de BRP se solubilizaron en dimetilsulfóxido (DMSO) al 5% y se diluyeron en caldo Brucella suplementado con hemina (5,0 mg/mL) y menadiona (1,0 mg/mL); Se utilizó una dilución seriada doble con concentraciones que oscilaban entre 0,195 y 400 µg/mL. Se realizó el control de DMSO al 5% y el disolvente no interfirió con el crecimiento bacteriano a esta concentración. También se realizaron los siguientes controles: inóculo (todas las bacterias utilizadas en el ensayo + el medio de cultivo), para observar la viabilidad de las bacterias; caldo, para garantizar que el medio de cultivo sea estéril; y muestra BRP, para garantizar que esta solución es estéril. Las microplacas se incubaron en una cámara anaeróbica (Don WhitleyScientific, Bradford, Reino Unido) en condiciones anaeróbicas (80 % N2, 10 % CO2 y 10 % H2) a 37 °C durante 72 h. Rezasurin se utilizó para revelar el crecimiento bacteriano: el color azul indicaba la ausencia de crecimiento bacteriano y el color rosa indicaba la presencia de bacterias53. Como técnica de control se utilizó metronidazol de 0.0115 a 5.9 μg/mL contra las bacterias control Bacteroides fragilis (ATCC 25285) y Bacteroides thetaiotaomicron (ATCC 29741)52.

Para evaluar la actividad antibiopelícula, las muestras de BRP que presentaron los resultados de MIC más prometedores frente a cuatro o más bacterias se sometieron al ensayo de Concentración Inhibitoria Mínima de Biopelícula (MICB50). MICB50 se define como la concentración más baja del agente microbiano que puede inhibir la formación de biopelículas en al menos un 50 %40 y se calcula mediante la siguiente ecuación:

Aquí, MICB50 se determinó como se describe en las guías CLSI (2007)52, con modificaciones. Primero, se verificó la capacidad de las cepas analizadas para crecer en el modo sésil. Todas las cepas a 1,5 × 106 CFU/mL formaron biopelículas monoespecies y multiespecies después de la incubación a 37 °C durante 72 h (datos no mostrados).

Para los biofilms monoespecies, se adicionó al pocillo con las muestras de propóleos a evaluar en concentraciones de 0,195 a 400 µg/mL (extracto hidroalcohólico crudo, oblongifolina B y gutferona E) 100 μL de cada inóculo bacteriano a 1,5 × 106 UFC/mL. . Las microplacas se incubaron en una cámara anaerobia a 37 °C durante 72 h. Para las biopelículas multiespecies, se seleccionaron las principales bacterias periodontopatógenas que se encuentran en la biopelícula oral y se dividieron en dos grupos: el grupo 1 consistió solo de las bacterias estándar (P. gingivalis ATCC 49417, P. intermedia ATCC 15033 y A. naeslundii ATCC 19039) , mientras que el grupo 2 estuvo compuesto únicamente por los aislados clínicos de P. gingivalis, P. intermedia y F. nucleatum. La actividad antibiopelícula de las muestras de BRP más prometedoras se evaluó frente a la biopelícula multiespecies formada por bacterias del grupo 1 y frente a la biopelícula multiespecies compuesta por bacterias del grupo 2. Para ello se adicionó a los pocillos con las muestras de propóleos a evaluar en concentraciones de 0,195 a 400 µg/mL (extracto hidroalcohólico crudo , oblongifolina B y gutferona E). Las microplacas se incubaron en las mismas condiciones que las microplacas de biopelícula monoespecies. El antibiótico estándar metronidazol se utilizó como control en concentraciones de 0,0115 a 5,9 μg/mL con MIC50 (consulte el material complementario, Figuras S2 y S3). Se realizó el control de DMSO al 5% y el disolvente no interfirió con el crecimiento bacteriano a esta concentración. También se realizaron los siguientes controles: inóculo (todas las bacterias utilizadas en el ensayo + el medio de cultivo), para observar la viabilidad de las bacterias; caldo, para garantizar que el medio de cultivo sea estéril; y muestra BRP, para garantizar que esta solución es estéril. Después de la incubación, se retiró el sobrenadante del cultivo y se eliminaron las células planctónicas lavando los pocillos con agua destilada ultrapura. Las biopelículas monoespecies y multiespecies se fijaron con metanol y se tiñeron con cristal violeta al 2%54. La lectura se realizó en un lector de microplacas (GloMax®) a 595 nm. La lectura se realizó en un lector de microplacas (GloMax®) a 595 nm. Los experimentos se llevaron a cabo en eventos independientes y por triplicado.

Este ensayo se realizó para biopelículas monoespecies y multiespecies según de Souza Silva et al.39, como se describe a continuación. Se incubaron dos microplacas, una para determinación de MICB50 y otra para recuento de microorganismos. Después de incubar la microplaca de recuento de microorganismos, se retiró el sobrenadante y se eliminaron las células planctónicas lavando los pocillos con agua destilada ultrapura. Posteriormente, se añadió caldo de Brucella suplementado a todos los pocillos de la microplaca y el biofilm se separó del pocillo después de un baño de ultrasonidos. Luego, se realizaron diluciones seriadas de diez veces en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, y se colocaron 50 μL de cada pocillo, correspondientes a cada dilución evaluada, en dos placas de agar Brucella suplementado con sangre de caballo (5%), hemina (5,0 mg /ml) y menadiona (1,0 mg/ml). Cada una de las placas se fraccionó en ocho partes, como describen Harrison et al.55 y se incubaron en cámara anaerobia a 37 °C. Después de 72 h, se realizó el conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en cada placa. Los resultados se expresaron como Log10 (UFC/ml) y los ensayos se realizaron de forma independiente por triplicado.

Las células BHK-21 (fibroblastos derivados de riñón de hámster dorado sirio; ATCC CCL-10) se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich) suplementado con 100 U/mL de penicilina (Hyclone Laboratories), 100 mg/mL de estreptomicina (Hyclone Laboratories), dilución al 1 % de la reserva de aminoácidos no esenciales (Hyclone Laboratories) y suero bovino fetal al 1 % (FBS, Hyclonen Laboratoires) en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % a 37 °C.

La viabilidad de las células BHK-21 en presencia de las muestras de BRP analizadas se midió mediante el ensayo MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro] (Sigma-Aldrich). Las células BHK-21 se cultivaron en microplacas de 48 pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de la muestra de BRP analizada a 37 °C durante 16 h. Luego, los medios que contenían la muestra de BRP analizada se retiraron de la microplaca de 48 pocillos. A continuación, se añadió una solución de MTT de 1 mg/mL a cada pocillo, se incubó durante 30 min y se reemplazó con 300 μL de DMSO para solubilizar los cristales de formazán. La absorbancia se midió a 490 nm en un lector de microplacas Glomax (Promega). La viabilidad celular se calculó según la ecuación (T/C) × 100 %, donde T y C representan la densidad óptica del pozo tratado y los grupos de control, respectivamente. Se usó DMSO como control sin tratar50.

Para la detección inicial de la actividad anti-CHIKV del extracto hidroalcohólico crudo de BRP y los compuestos aislados, se sembraron células HK-21 a una densidad de 5 × 104 células por pocillo en microplacas de 48 pocillos 24 h antes de la infección. CHIKV-nanoluc a una multiplicidad de infección56 de 0,1 y el compuesto o extracto aislado analizado se añadieron simultáneamente a las células. Las células se recolectaron en tampón de lisis de luciferasa de Renilla (Promega) 16 h después de la infección (hpi), y la replicación del virus se cuantificó midiendo la actividad de la nanoluciferasa con el sistema de ensayo de luciferasa de Renilla (Promega). Las tasas de replicación de CHIKV se calcularon de acuerdo con la ecuación (T/C) × 100 %, donde T y C representan la densidad óptica del pozo tratado y los grupos de control, respectivamente. Se utilizó DMSO al 0,1 % como control sin tratar.

La evaluación de toxicidad se realizó para las muestras de BRP más prometedoras en el CIM, utilizando el modelo in vivo de C. elegans, según Andrade et al.57 y Singulani et al.58. La cepa mutante AU37 de C. elegans se cultivó en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli OP50 y se incubaron a 16 °C durante 72 h. Después de la incubación, las placas NGM que contenían larvas y huevos se lavaron con tampón M9 y el sobrenadante se colocó en tubos cónicos de 15 ml. Se añadió además una solución blanqueadora (hipoclorito + NaOH) para matar las larvas adultas. Los huevos se colocaron en placas NGM y se incubaron nuevamente a 15 °C durante 24 h. Posteriormente, las placas NGM que contenían las larvas en los estadios L1/L2 se lavaron con tampón M9 y el sobrenadante se transfirió a placas NGM sembradas con E. coli OP50 y se incubaron a 16 °C durante 24 h. Después de la sincronización, se agregaron 20 µL del contenido de la placa NGM que contenía de 10 a 20 larvas en etapa L4 a cada pocillo de una microplaca de fondo plano de 96 pocillos y se incubó a 16 °C durante 72 h. El extracto hidroalcohólico crudo BRP se evaluó de 750 a 6000 μg/mL, y los compuestos aislados oblongifolina B y gutferona E se evaluaron de 5,85 a 1500 μg/mL. Se usó DMSO como solvente (concentración final ≤ 1%).

Las larvas se contaron cada 24 h durante tres días consecutivos bajo un microscopio invertido. Las larvas con movimiento se consideraron vivas y las estáticas incluso después de tocarlas se consideraron muertas. Para cada muestra se determinó la concentración más baja que fue capaz de matar el 50% de las larvas, denominada Concentración Letal (LC50), según el tiempo.

Los experimentos individuales se realizaron por triplicado y todos los ensayos se realizaron un mínimo de tres veces para confirmar la reproducibilidad de los resultados. Las diferencias entre las medias de las lecturas se compararon mediante análisis de varianza (ANOVA unidireccional o bidireccional) o la prueba t de Student realizada con el software Graph Pad Prism 8.0 (Graph Pad Software). Los valores de p ≤ de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementaria).

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Este trabajo fue financiado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Beca FAPESP # 2017/04138–8), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG # 12138—Beca otorgada; APQ-03385–18 y APQ-01487–22), Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES Código Financiero 001—Beca otorgada y Prevención y Combate a Brotes, Endemias, Epidemias y Pandemias—Código Financiero #88881.506794/2020–01) y Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Beca CNPq # 307974/2019–7).

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Nagela Bernadelli Sousa Silva, Jonathan Henrique de Souza, Mariana Brentini Santiago, Jhennyfer Rodrigues da Silva Aguiar, Daniel Oliveira Silva Martins, Igor de Andrade Santos, Ana Carolina Gomes Jardim & Carlos Henrique Gomes Martins

Instituto de Biociencias, Letras y Ciencias Exactas (IBILCE), Universidad del Estado de Sao Paulo, São José Do Rio Preto, Brasil

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Rafael Alves da Silva

Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Ribeirão Preto, Universidad de São Paulo (USP), Ribeirão Preto, Brasil

Jennifer A. Aldana-Mejía & Jairo Kenupp Bastos

Escuela Técnica de Salud (ESTES), Universidad Federal de Uberlândia, Uberlândia, Brasil

Reginaldo dos Santos Pedroso

Núcleo de Ciencias Exactas y Tecnológicas, Universidad de Franca (UNIFRAN), Franca, Brasil

Sergio Ricardo Ambrósio y Rodrigo Cassio Sola Veneziani

Programa de Posgrado en Promoción de la Salud, Universidad de Franca (UNIFRAN), Franca, Brasil

Regina Helena Pires

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Correspondence to Carlos Henrique Gomes Martins.

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Recibido: 22 agosto 2022

Aceptado: 21 de noviembre de 2022

Publicado: 07 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24776-4

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